RNAi下調CCT8抑制非小細胞肺癌A549細胞轉移潛能

朱迎偉 褚旭 邱家勇 孫瑜霞 毛毅敏

肺癌大多數起源于支氣管黏膜上皮，是最為常見的肺組織原發惡性腫瘤，肺癌中有80%的患者屬于非小細胞肺癌，研究非小細胞肺癌發生機制對于靶向基因治療肺癌具有重要意義［1］。含有TCP1伴侶蛋白亞基8（Chaperonin containing TCP1，subunit 8，CCT8）是一種在生命體內存在的分子伴侶，參與DNA復制、多肽折疊、細胞信號轉導、蛋白降解等過程，CCT8屬于Ⅱ型伴侶素，參與腫瘤進展［2］。研究報道顯示，CCT8在腫瘤中表達上調，并且其表達改變與腫瘤患者的預后、轉移等有關［3］。在膠質瘤中的研究表明，CCT8在膠質瘤中高表達與膠質瘤分級有關，沉默CCT8可以有效抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲［4］。以前的研究報道顯示，CCT8在非小細胞肺癌組織中高表達，并且其表達水平同肺癌患者淋巴結轉移、預后、組織學分級等有關［5］。目前對于CCT8對非小細胞肺癌細胞侵襲、遷移和上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用還不明確。本次實驗以非小細胞肺癌A549細胞作為體外實驗對象，探討下調CCT8對細胞增殖和惡性轉移潛能的影響，以期為尋找有效的靶基因治療肺癌提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細胞肺癌A549細胞購自上海信裕生物科技有限公司；Lipofectamine 2000、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、十二烷基硫酸鈉，鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulfate，sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Vimentin抗體和p-Akt抗體購自美國santacruze；CCT8抗體購自美國Proteintech；E-cadherin抗體、MMP-9抗體購自北京義翹神州科技有限公司；siRNA control、CCT8 siRNA由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成。

1.2 細胞轉染

A549細胞分成3組，分別為Control、si-NC、si-CCT8組，si-NC、si-CCT8組分別為轉染siRNA control、CCT8 siRNA的A549細胞，Control為不做轉染的對照A549細胞。A549細胞轉染方法按照轉染試劑Lipofectamine 2000進行，步驟完全按照操作說明書標準流程操作。

1.3 Realtime PCR方法檢測CCT8 siRNA對CCT8 mRNA表達影響

收集轉染48 h以后的Control、si-NC、si-CCT8組細胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA，按照試劑盒說明書操作進行PCR反應。按照2-ΔΔCT法分析CCT8水平。

1.4 Western blot方法檢測CCT8 siRNA對CCT8蛋白表達影響

收集轉染48 h以后的Control、si-NC、si-CCT8組細胞，按蛋白提取試劑盒提取總蛋白，以BCA方法定量。具體方法參考文獻［2］，CCT8蛋白水平=CCT8條帶灰度值÷內參GAPDH灰度值

1.5 MTT檢測檢測CCT8 siRNA對細胞增殖影響

取Control、si-NC、si-CCT8組培養48 h的細胞。按照MTT試劑盒說明書進行檢測細胞增殖。

1.6 Transwell小室檢測CCT8 siRNA對細胞侵襲和遷移影響

用不含血清的培養液懸浮Control、si-NC、si-CCT8組細胞，按照參考文獻［2］方法檢測細胞侵襲和遷移數量。

1.7 Western blot檢測CCT8 siRNA對MMP-9、Vimentin、E-cadherin和p-Akt蛋白表達影響

收集轉染48 h以后的Control、si-NC、si-CCT8組細胞，按照1.4中方法檢測蛋白表達變化，內參為GAPDH。

1.8 Akt信號激活劑對下調CCT8影響細胞增殖、遷移、侵襲和EMT的影響

取轉染CCT8 siRNA后的A549細胞，以含有100 ng/mL的Akt激活劑IGF-1的細胞培養液培養，記為si-CCT8+IGF-1，以si-CCT8作為對照，分別按照1.4、1.5、1.6中的方法分別檢測MMP-9、Vimentin、E-cadherin和p-Akt蛋白表達，細胞遷移和侵襲，細胞增殖。

1.9 統計分析

采用SPSS 21.0軟件統計分析，計量資料用（）表示，兩組數據用獨立樣本t檢驗，多組比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCT8siRNA下調A549細胞中CCT8表達水平

與si-NC組相比，轉染CCT8 siRNA后A549細胞中CCT8mRNA和蛋白水平均下降差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1和表1。

2.2 下調CCT8對A549細胞增殖、侵襲、遷移影響

與si-NC組相比，轉染CCT8 siRNA后A549細胞中細胞A值、侵襲數目和遷移數目均下降（P＜0.05），見表2。

圖1 Western blot檢測CCT8 siRNA轉染后A549細胞中CCT8蛋白水平Figure 1 Western blot analysis expressions of CCT8 protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA

表1 CCT8 siRNA轉染后A549細胞中CCT8 mRNA和蛋白水平（±s）Table 1 Expressions of CCT8 mRNA and protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

表1 CCT8 siRNA轉染后A549細胞中CCT8 mRNA和蛋白水平（±s）Table 1 Expressions of CCT8 mRNA and protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

組別對照組si-NC si-CCT8 F值P值CCT8 mRNA 1.00±0.09 1.01±0.12 0.40±0.04 45.573 0.000 CCT8蛋白0.48±0.06 0.49±0.07 0.21±0.02 25.517 0.001

表2 CCT8 siRNA轉染后A549細胞A值、侵襲數目和遷移數目（±s）Table 2 A value，number of invasion and number of migration in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

表2 CCT8 siRNA轉染后A549細胞A值、侵襲數目和遷移數目（±s）Table 2 A value，number of invasion and number of migration in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

組別對照組si-NC si-CCT8 F值P值A值0.51±0.06 0.50±0.04 0.21±0.03 42.836 0.000侵襲數目95.54±10.20 97.36±9.87 60.17±2.05 19.237 0.003遷移數目138.64±12.02 140.08±11.49 86.95±7.53 24.745 0.000

圖2 Western blot檢測CCT8 siRNA轉染后A549細胞中MMP-9和Vimentin、E-cadherin蛋白水平Figure 2 Western blot analysis expressions of MMP-9,Vimentin and E-cadherin protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA

2.3 下調CCT8對A549細胞MMP-9蛋白和EMT相關蛋白表達影響

與si-NC組相比，轉染CCT8 siRNA后A549細胞中MMP-9蛋白水平降低上皮標志蛋白E-cadherin水平升高，間質標志蛋白Vimentin P-kAT水平下降（P＜0.05），表3和見圖2。

表3 CCT8 siRNA轉染后A549細胞中MMP-9和Vimentin、E-cadherin、p-Akt水平（±s）Table 3 Expressions of MMP-9，Vimentin and E-cadherin、p-Akt in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

表3 CCT8 siRNA轉染后A549細胞中MMP-9和Vimentin、E-cadherin、p-Akt水平（±s）Table 3 Expressions of MMP-9，Vimentin and E-cadherin、p-Akt in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

注：與si-NC比較，a P＜0.05。

組別對照組si-NC si-CCT8 F值P值MMP-9 0.47±0.05 0.48±0.03 0.28±0.04 22.860 0.002 Vimentin 0.53±0.06 0.52±0.04 0.30±0.04 22.368 0.002 E-cadherin 0.31±0.05 0.32±0.03 0.46±0.05 10.729 0.010 p-Akt/Akt 0.31±0.04 0.33±0.06 0.16±0.02 13.875 0.000

2.4 下調CCT8對A549細胞中Akt信號通路影響

與si-NC組相比，轉染CCT8 siRNA后A549細胞中p-Akt蛋白水平降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 Western blot檢測CCT8 siRNA轉染后A549細胞中p-Akt蛋白水平Figure 3 Western blot analysis expressions of p-Akt protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA

2.5 Akt信號激活劑對下調CCT8抑制A549細胞增殖、侵襲、遷移和EMT的逆轉作用

Akt信號激活劑IGF-1處理CCT8 siRNA轉染后的A549細胞，與si-CCT8組相比，si-CCT8+IGF-1組細胞MMP-9、Vimentin蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低，細胞A值、侵襲數目和遷移數目升高（P＜0.05），見圖4和表4。

圖4 Western blot檢測Akt信號激活劑和CCT8 siRNA轉染后A549細胞中p-Akt、E-cadherin、MMP-9、Vimentin蛋白水平Figure 4 Western blot analysis expressions of p-Akt，E-cadherin，MMP-9，Vimentin protein in A549 cells after Akt signaling activator and CCT8 siRNA transfection

表4 Akt信號激活劑和CCT8 siRNA轉染后A549細胞A值、侵襲數目、遷移數目和p-Akt、E-cadherin、MMP-9、Vimentin蛋白水平（±s）Table 4 A value，invasion number，migration number and p-Akt，E-cadherin，MMP-9，Vimentin protein levels of A549 cells after Akt signaling activator and CCT8 siRNA transfection（±s）

表4 Akt信號激活劑和CCT8 siRNA轉染后A549細胞A值、侵襲數目、遷移數目和p-Akt、E-cadherin、MMP-9、Vimentin蛋白水平（±s）Table 4 A value，invasion number，migration number and p-Akt，E-cadherin，MMP-9，Vimentin protein levels of A549 cells after Akt signaling activator and CCT8 siRNA transfection（±s）

組別si-CCT8 si-CCT8+IGF-1 t值P值p-Akt/Akt 0.17±0.03 0.41±0.05 7.129 0.002 MMP-9 0.29±0.03 0.52±0.06 5.939 0.004 Vimentin 0.28±0.04 0.44±0.05 4.328 0.012 E-cadherin 0.50±0.06 0.31±0.04 4.564 0.010 A值0.22±0.04 0.45±0.05 6.222 0.003侵襲數目62.81±3.69 85.14±6.34 5.272 0.006遷移數目87.98±9.62 127.42±11.73 4.503 0.011

3 討論

CCT8參與腫瘤進程，研究顯示，CCT8在肝細胞癌中高表達，與預后不良有關，siRNA沉默CCT8抑制細胞增殖并阻斷細胞進入S期［6］。在肝癌中發現下調CCT8可以降低肝癌細胞遷移和侵襲能力［7］。還有研究發現CCT8在淋巴結轉移的食管鱗狀細胞癌患者腫瘤組織中高表達，與患者預后不良和順鉑耐藥性相關；敲低CCT8通過調節α-肌動蛋白和β-微管蛋白抑制食管鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲，促進細胞凋亡［8］。本實驗表明，下調CCT8可以在體外抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，這與在肝癌、食管鱗狀細胞癌中下調CCT8抑制癌細胞遷移和侵襲的作用相同。還有研究發現CCT8上調與成年大鼠創傷性腦損傷后神經細胞凋亡有關［9］。但本實驗未研究CCT8對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響。以上結果表明說明CCT8在癌癥中可能作為一個腫瘤促進因子在起作用。本實驗結果顯示下調CCT8具有抑制非小細胞肺癌細胞惡性表型的作用，靶向抑制CCT8可能是有效抵抗非小細胞肺癌進展的途徑。

基質金屬蛋白酶9（Matrix metallo proteinase-9，MMP-9）是基質金屬蛋白酶家族的成員，細胞外基質降解的關鍵酶［10］。而細胞外基質降解是腫瘤細胞轉移的基礎和前提條件［11］。有研究報道MMP-9在非小細胞肺癌中高表達，與腫瘤分期及淋巴結轉移關系密切，且與癌細胞侵襲轉移呈正相關［12］。還有研顯示，非小細胞肺癌組織中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）低表達、波形蛋白（Vimentin）高表達，在腫瘤的侵襲和轉移過程中起重要調控作用［13］；E-cadherin和Vimentin是EMT水平改變的標志，EMT水平越高標志著腫瘤轉移能力越強，有研究報道通過調節EMT可促進肺癌細胞侵襲和遷移能力［14］。本次實驗結果表明，下調CCT8可以抑制MMP-9的表達，促進E-cadherin表達，并下調Vimentin表達水平。

綜上，CCT8可能是非小細胞肺癌治療的有效靶標，靶向抑制CCT8表達可以降低非小細胞肺癌細胞惡性增殖、遷移、侵襲和EMT，且CCT8作用機制與Akt信號有關。本實驗結果為研究CCT8在肺癌中的作用機制提供了參考。在以后實驗中會探討CCT8具體的靶向結合位點和調控網絡。