let-7d-5p調控HPV16陽性宮頸癌細胞侵襲、遷移及凋亡的分子機制

張鵬飛 周保成 周哲 朱美玲 戚耀之★

宮頸癌是世界上第二大常見的女性惡性腫瘤，其在發展中國家的婦科腫瘤中排第二位［1］。目前的研究表明宮頸癌與高危型人乳頭瘤病毒（High risk human papillomavirus，HPV）的感染密切相關，但仍有大量宮頸癌患者未感染HPV，這表明其他因素如細胞遺傳變化也可導致疾病進展［2-3］。宮頸癌的主要治療方法是手術（包括盆腔淋巴結切除術和根治性子宮切除術）、放療和化療。近年來，靶向治療正成為研究熱點，目前主要用于治療宮頸癌的靶向治療是針對EGFR［4］和COX-2基因［5］。人類白細胞介素10（Human interleukin 10，IL-10）在多種癌癥中均具有促進癌癥進一步惡化的作用，包括宮頸癌［6］。本研究將檢測其中let-7d-5p、IL-10的表達，觀察過表達let-7d-5p、敲減IL-10、過表達IL-10對Caski細胞遷移侵襲和凋亡的影響，揭示其機制與let-7d-5p靶向抑制IL-10有關，為宮頸癌的精準治療提供靶標參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic、人乳頭瘤病毒相關宮頸鱗癌細胞Caski（美國菌種保存中心）；DMEM培養基（Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；胰蛋白酶（美國Sellect公司）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen）；逆轉錄試劑盒（大連Takara）；PVDF膜（上海安普公司）；SDS-PAGE試劑盒（北京Leagene）、ECL發光液和RIPA蛋白裂解液（碧云天）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega）；Matrigel基質膠（美國BD）；Transwell小室（美國Coming）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic、人乳頭瘤病毒相關宮頸鱗癌細胞Caski使用DMEM培養基（含10%胎牛血清）培養，在常規細胞培養箱（37℃，5%CO2，95%O2）中培養，每2 d傳代一次。

1.2.2 細胞的轉染與分組

將正常培養的Caski細胞隨機分為miR-NC組（轉染miR-NC）、let-7d-5p組（轉染let-7d-5p mimics）、anti-miR-NC組（轉染anti-miR-NC）、anti-let-7d-5p組（轉染anti-let-7d-5p）、si-NC組（轉染si-NC）、si-IL-10組（轉染si-IL-10）、let-7d-5p+pc DNA組（共轉染let-7d-5p mimics和pc DNA）、let-7d-5p+pc DNA-IL-10組（共轉染let-7d-5p mimics和pc DNAIL-10），將合成的DNA與3倍體積的培養液稀釋混勻，取100μL加入需轉染的細胞，培養約4～6 h后，更換新鮮培養基培養48 h，最后通過RT-qPCR實驗檢測轉染效率。

1.2.3 RT-qPCR法檢測細胞中let-7d-5p、IL-10的mRNA表達

Trizol法提取細胞RNA，并用紫外吸光法進行定量。迅速進行逆轉錄反應，以免RNA發生降解，采用逆轉錄試劑盒，操作按照試劑盒說明書進行，合成模板鏈cDNA。每個樣品重復3次，取平均值，反應結束后通過比較Ct值，以U6、GAPDH作為內參，計算2-ΔΔCt的值，測定let-7d-5p、IL-10的相對表達水平。逆轉錄反應體系為20μL，設置反應條件為55℃，30 min；85℃，5 min；4℃，5 min，結束后即為cDAN。RT-qPCR反應體系為20μL，設置反應條件為：94℃，2 min；94℃，30 min；58℃，30 s；72℃，30 s，延伸溫度72℃，2 min，45個循環。

1.2.4 Western blot檢測細胞中IL-10的蛋白表達

收集適量細胞，PMSF裂解液裂解細胞，提取總蛋白，用BCA法進行總蛋白定量，再進行沸水浴變性10 min，離心后取上清進行蛋白電泳、轉膜、孵育（一抗和二抗）。Quantity One 4.62分析目的蛋白IL-10的灰度值。

1.2.5 Transwell小室檢測細胞的遷移侵襲

將Transwell小室置于孔上，放入細胞培養箱平衡30 min。然后將各組細胞消化，用DMEM培養基配制成5×105個/mL的細胞懸液。每個小室加入200μL細胞懸液，即每孔細胞約為1×105個，將24孔板置于細胞培養箱培養24 h，小心取出小室，擦去上室下表面發生遷移的細胞，用PBS清洗、甲醇固定（25 min）。最后用結晶紫染液（1 g/L）進行染色處理15～20 min，用PBS清洗。最后在倒置顯微鏡下觀察拍照，隨機選取5個視野分別計數、拍照，取平均值。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集細胞，消化后用結合緩沖液調整細胞至106個/mL，每孔加入100μL細胞液，再加入Annexin V-/FITC（5μL）、PI（10μL）避光反應15 min，結束后快速上流式細胞儀分析凋亡情況。

1.2.7 熒光素酶報告檢測細胞let-7d-5p、IL-10結合力

采用在線靶基因預測庫Target Scan（http：//www.targetscan.org/）檢測到let-7d-5p與IL-10 3′UTR存在結合位點，為了驗證這一預測，將IL-10 3′-UTR-WT（含IL-10 3′-UTR片段）和IL-10 3′-UTR-MUT（含IL-10 3′-UTR突變體片段）的熒光素酶報告載體，并將其與let-7d-5p mimics、miR-NC共轉染48 h后，用雙重熒光素酶測定法檢測螢火蟲和海腎的熒光活性，以判定let-7d-5p與IL-10是否具有結合力。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。計量資料用（）表示，多組間多重比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 let-7d-5p、IL-10在宮頸癌細胞中的表達

與HcerEpic組相比，Caski組細胞中let-7d-5p mRNA表達顯著降低，IL-10 mRNA和蛋白表達均顯著升高差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1，表1。

圖1 IL-10在宮頸癌細胞中的蛋白表達Figure 1 IL-10 protein expression in cervical cancer cells

表1 let-7d-5p、IL-10在宮頸癌細胞中的表達（±s）Table 1 Expression of let-7d-5p and IL-10 in cervical cancer cells（±s）

表1 let-7d-5p、IL-10在宮頸癌細胞中的表達（±s）Table 1 Expression of let-7d-5p and IL-10 in cervical cancer cells（±s）

組別HcerEpic組Caski組t值P值let-7d-5p 1.00±0.06 0.31±0.03a 30.858 0.000 IL-10 1.00±0.07 2.86±0.02 76.647 0.000 IL-10 1.00±0.05 1.68±0.01 40.008 0.000

2.2 let-7d-5p過表達對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

與miR-NC組相比，let-7d-5p組細胞中let-7d-5p表達顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 過表達let-7d-5p對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of over-expression of let-7d-5p on migration，invasion and apoptosis of cervical cancer cells（±s，n=9）

表2 過表達let-7d-5p對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of over-expression of let-7d-5p on migration，invasion and apoptosis of cervical cancer cells（±s，n=9）

組別miR-NC組let-7d-5p組t值P值let-7d-5p 0.99±0.05 4.12±0.04 146.647 0.000細胞數（個）遷移99±7 51±5 16.740 0.000侵襲75±7 35±3 15.757 0.000凋亡率6.56±0.46 18.18±1.02 31.155 0.000

2.3 let-7d-5p靶向IL-10

通過生物信息學軟件Target Scan分析得到，let-7d-5p可以與IL-10的3′-UTR相互結合見圖2；熒光素酶報告結果顯示，與miR-NC組相比，過表達let-7d-5p的WT-3′-UTR-IL-10細胞的熒光素酶活性異常降低（P＜0.05），見表3；與miR-NC組相比，過表達let-7d-5p的細胞中IL-10的表達明顯降低，與anti-miR-NC組相比，抑制let-7d-5p的細胞中IL-10表達則異常升高（P＜0.05）。見圖3，表4。

圖2 let-7d-5p與IL-10的靶向結合位點Figure 2 Target binding sites of let-7d-5p and IL-10

表3 雙熒光素酶報告基因檢測結果（±s，n=9）Table 3 Double luciferase reporter gene test results（±s，n=9）

表3 雙熒光素酶報告基因檢測結果（±s，n=9）Table 3 Double luciferase reporter gene test results（±s，n=9）

分組miR-NC組let-7d-5p組t值P值WT-IL-10 1.00±0.09 0.22±0.01 25.841 0.000 MUT-IL-10 1.00±0.08 0.99±0.06 0.300 0.768

圖3 IL-10的蛋白表達Figure 3 IL-10 protein expression

表4 let-7d-5p對IL-10表達的影響（±s,n=9）Table 4 Effect of let-7d-5p on IL-10 expression（±s,n=9）

表4 let-7d-5p對IL-10表達的影響（±s,n=9）Table 4 Effect of let-7d-5p on IL-10 expression（±s,n=9）

分組anti-miR-NC組anti-let-7d-5p組miR-NC組let-7d-5p組F值P值IL-10 protein 1.00±0.12 5.09±0.52 1.00±0.11 0.21±0.02 590.503 0.000

2.4 敲減IL-10對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

與si-NC組相比，si-IL-10組細胞中IL-10蛋白表達顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表5 敲減IL-10對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s,n=9）Table 5 Effect of knockdown of IL-10 on migration,invasion and apoptosis of cervical cancer cells（±s,n=9）

表5 敲減IL-10對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s,n=9）Table 5 Effect of knockdown of IL-10 on migration,invasion and apoptosis of cervical cancer cells（±s,n=9）

組別si-NC si-IL-10 t值P值IL-10 protein 0.99±0.05 0.22±0.02a 42.896 0.000細胞數（個）遷移100±9 46±4 16.449 0.000侵襲85±8 33±3 18.258 0.000凋亡率8.35±0.78 18.02±1.01 22.733 0.000

2.5 過表達IL-10逆轉let-7d-5p對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

與let-7d-5p+pc DNA組相比，let-7d-5p+pc DNA-IL-10組細胞中let-7d-5p表達顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見表6。

3 討論

miRNA在人類各種癌癥的發生發展中作為致癌基因或抑癌基因發揮調控作用，對靶基因的調控作用是腫瘤發生發展的關鍵［7］。Honegger等［8］在HPVs誘導的宮頸癌的研究中發現，在HeLa細胞分泌的外泌體中，最豐富的miRNA中鑒定出明顯的7個miRNA，其中let-7d-5p、miR-20a-5p、miR-378a-3p、miR-423-3p顯著下調，miR-7-5p、miR-92a-3p和miR-21-5p的上調，這幾種依賴E6/E7的外泌體miRNA也與細胞增殖和凋亡有關，該研究提示病毒致癌基因的表達可影響miRNA的表達，這些miRNA也可能影響HPV陽性宮頸癌細胞的生長。Zheng等［9］在宮頸癌的研究中發現，Let-7d-3p、Let-7a-3p的表達均顯著降低，并且這與其在血漿樣品中的表達相一致，揭示血漿外泌體let-7d-3p是用于宮頸癌及其前體的非侵入性篩選的有價值的診斷生物標志物。本研究進一步發現，過表達let-7d-5p可抑制Caski細胞遷移侵襲，促進凋亡，這是國內外首次公開報道let-7d-5p在宮頸癌細胞中的抑制遷移侵襲，促進凋亡作用，為開發let-7d-5p在宮頸癌中的診斷、治療潛力提供充分的理論依據。

表6 過表達IL-10逆轉let-7d-5p對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Table 6 Overexpression of IL-10 reverses the effect of let-7d-5p on migration,invasion and apoptosis of cervical cancer cells（±s，n=9）

表6 過表達IL-10逆轉let-7d-5p對宮頸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Table 6 Overexpression of IL-10 reverses the effect of let-7d-5p on migration,invasion and apoptosis of cervical cancer cells（±s，n=9）

組別let-7d-5p let-7d-5p+pc DNA let-7d-5p+pc DNA-IL-10 F值P值let-7d-5p 1.00±0.08 0.99±0.05 0.22±0.02 581.323 0.000細胞數（個）遷移52±5 50±5 85±6 121.291 0.000侵襲31±3 32±3 64±6 176.167 0.000凋亡率18.97±1.24 18.02±1.36 9.88±0.48 186.327 0.000

IL-10可通過抑制抗腫瘤抑制因子產生、抑制巨噬細胞的吞噬、利于腫瘤的生長擴散，發揮促進癌癥的進一步惡化作用［10］。Berti等［11］報道，宮頸癌中IL-10水平傾向于與鱗狀上皮病變發展而增加，并且在宮頸腫瘤中含量甚至更高，有數據顯示，HPV感染后，由于HPV E2、E6和E7蛋白對IL-10基因轉錄的促進作用，IL-10水平增強，而IL-10刺激HPV E6和E7表達，因此HPV和IL-10之間的這種相互作用產生了惡性循環，可能有利于子宮頸中的免疫抑制微環境，促進HPV感染的上皮細胞進展為宮頸癌。Min等［12］在研究中結果揭示聯合檢測IL-10和HPV感染可改善宮頸上皮內瘤變和早期宮頸癌的診斷。

綜上所述，let-7d-5p可抑制宮頸癌細胞遷移侵襲，促進凋亡，其機制可能是通過靶向并調控IL-10表達有關，本研究結果為宮頸癌的治療提供了新靶點研究方向。