外周血與骨髓組織髓系來源抑制細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤患者診斷中的價(jià)值比較

張睿婷 方霽 周雅瑩 周繼豪 劉應(yīng)達(dá)

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種以貧血、骨破壞、高免疫球蛋白與低白蛋白血癥為主要特征的克隆性漿細(xì)胞異常增殖性疾病，占所有血液腫瘤的10%，腫瘤微環(huán)境在維持骨髓瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)耐藥、協(xié)助免疫逃逸等多個(gè)方面發(fā)揮了重要作用［1］，這是導(dǎo)致其治療效果不理想的一個(gè)重要因素。近年來，髓系來源抑制細(xì)胞（Myeloid Derived Suppressive Cells，MDSCs）在MM腫瘤微環(huán)境中的作用引起廣泛關(guān)注［1］。目前認(rèn)為MDSCs是源于髓系干祖細(xì)胞的一群幼稚細(xì)胞，在人體內(nèi)以CD33+/CD11b+/Lin-/HLA-DR-為標(biāo)志［2］。2010年Brimnes［2］等發(fā)現(xiàn)MM患者發(fā)病時(shí)外周血MDSC明顯增多，首次提示MDSCs可能參與MM發(fā)病。MDSCs在腫瘤微環(huán)境中不僅直接涉及免疫抑制效應(yīng)，還可以非免疫方式間接促進(jìn)MM的發(fā)生發(fā)展。外周血中，MDSCs一方面使CD8+T細(xì)胞喪失對抗原刺激的免疫反應(yīng)；另一方面通過影響T細(xì)胞周期，并下調(diào)成熟T細(xì)胞表面TCR受體數(shù)量，誘導(dǎo)T細(xì)胞失能（Anergy）［3］。然而，MDSCs及其亞群在外周血與骨髓組織中的占比差異以及對疾病診斷的價(jià)值目前仍缺乏相關(guān)證據(jù)，因此，探討外周血與骨髓組織來源MDSCs的數(shù)量及純度差異，對MM診斷的靈敏度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

病例篩選：經(jīng)病理活檢或骨髓穿刺診斷明確的初發(fā)或復(fù)發(fā)MM患者入組。納入標(biāo)準(zhǔn)：初診或復(fù)發(fā)活動(dòng)性MM患者，需符合如下指標(biāo)中至少2項(xiàng)（必須包含第2項(xiàng)）：①骨髓中漿細(xì)胞大于15%并有原漿或幼漿細(xì)胞，或組織活檢證實(shí)為漿細(xì)胞瘤；②血清單克隆免疫球蛋白（M蛋白）IgG大于35、20、15、2 g/L；IgE大于2 g/L；尿中單克隆免疫球蛋白（本周蛋白）大于1 g/24 h；③廣泛骨質(zhì)疏松和/或溶骨病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：髓外漿細(xì)胞瘤、意義未明的單克隆免疫球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）、不分泌型骨髓瘤以及拒絕入組患者。

儀器與試劑：MDSCs表型檢測所用的儀器FACSCanto II流式細(xì)胞儀及單克隆抗體（McAb）、溶血?jiǎng)┑仍噭┚徸悦绹鳥ecton Dickinson（BD）公司。所測胞膜單克隆抗體（McAb）包括CD45-APC.CY5、CD33-FITC、CD14-PERCP、CD11b-APC、CD15-PE。檢測結(jié)果采用BD FACSDiva軟件分析

1.2 方法

1.2.1 全骨髓的細(xì)胞分離

所有患者均取仰臥位，以髂前上棘為穿刺點(diǎn)，碘伏常規(guī)皮膚消毒，利多卡因局部麻醉，進(jìn)行骨髓穿刺。收集標(biāo)本，制備細(xì)胞懸液，吹打混勻，放入10 mL離心管中，離心1 500 r/min，5 min，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液破紅3 min后，全培終止，離心1 500 r/min，5 min。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)后，2×107細(xì)胞用1 mL緩沖液重懸。

1.2.2 外周全血細(xì)胞制備

抽取納入者入院次日晨起空腹肘靜脈血3 mL，肝素鋰抗凝，取100μL靜脈全血置于流式管內(nèi)，依次加入熒光標(biāo)記抗體各2μL，于2～8℃環(huán)境中孵育30 min。而后加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，避光、室溫條件下孵育10 min，使用PBS洗滌，以適量流式染色緩沖液重懸染色細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.2.3 流式細(xì)胞的分選

取樣品100μL，加入五色單克隆抗體20μL，混勻后室溫避光放置15 min，加入1 mL 1×紅細(xì)胞裂解液，室溫避光放置10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，對沉淀物以PBS洗滌2次。加入500μL PBS重懸后上機(jī)檢測。用BD FACSDiva軟件設(shè)置獲取條件后，上樣獲取數(shù)據(jù)，每管獲取2×104個(gè)細(xì)胞。FSC-A/FSC-H去除粘連細(xì)胞，采用CD14/CD11B設(shè)門，分析CD11BdimCD14-細(xì)胞，CD15+CD33+細(xì)胞為G-MDSCs，CD15-CD33+細(xì)胞為M-MDSCs。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.00軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組間差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組來源M-MDSCs%、G-MDSCs及Total MDSCs%的比較分析

BM與PB來源樣本，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測M-MDSCs%，見圖1，PB組（0.062±0.022）顯著低于BM組（0.291±0.093），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0223）（圖1A）；G-MDSCs%與Total MDSCs%兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）見圖1B和C。

2.2 流式細(xì)胞技術(shù)對PB來源MDSCs的分選

外周血標(biāo)本設(shè)門及結(jié)果示例，分群較為理想，且不同患者標(biāo)本之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜005）。見圖2。

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)對BM來源MDSCs的分選

不同患者標(biāo)本G-MDSCs均占比較大，其中混雜大量早期粒細(xì)胞的干擾，共同表達(dá)為CD13和CD33而不表達(dá)HLA-DR，特異性較低。見圖3。

圖1 BM及PB來源M-MDSCs%、G-MDSCs%及Total MDSCs%的比較Figure 1 Comparison of BM and PB sourced M-MDSCs%，G-MDSCs%and Total MDSCs%

圖2 流式細(xì)胞技術(shù)對PB來源M-MDSCs%、G-MDSCs%的檢測Figure 2 M-MDSCs%and G-MDSCs%sourced PB by Flow cytometry

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)對BM來源M-MDSCs%、G-MDSCs%的檢測Figure 3 M-MDSCs%and G-MDSCs%sourced BM by Flow cytometry

3 討論

MM腫瘤微環(huán)境包含細(xì)胞成分和非細(xì)胞成分。細(xì)胞成分包括造血細(xì)胞成分和非造血細(xì)胞成分，作為非造血細(xì)胞成分的MDSCs近年來廣受關(guān)注［1］。

1987年Young［4］等在小鼠肺癌模型中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能分泌粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-Colony stimulating factor，G-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte Macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF）等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)形成具有免疫抑制作用的造血前體細(xì)胞，后來證實(shí)這些細(xì)胞均為髓系來源、都是不成熟細(xì)胞且能抑制T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)，而被正式命名為MDSCs，其不同亞型功能不同：M-MDSCs主要分泌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible Nitric oxide synthase，iNOS），G-MDSCs主要分泌精氨酸酶1（Arginase，ARG-1）。ROS與NO結(jié)合形成過氧亞硝基化合物，一方面引起T細(xì)胞表面抗原受體（Tcell receptor，TCR）TCR-CD8復(fù)合物中酪氨酸硝基化，失去對負(fù)載抗原肽的主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）受體的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞喪失對抗原刺激的免疫反應(yīng)［5］；另一方面也直接抑制抗原肽與腫瘤細(xì)胞表面MHC受體的結(jié)合，降低骨髓瘤細(xì)胞的免疫原性［6］，并能誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的成熟。MDSCs還能夠通過其細(xì)胞膜表面表達(dá)的解整合素金屬蛋白酶17（Disintegrin metalloproteinase 17，ADAM17）下 調(diào)native T細(xì)胞表面CD62L的表達(dá)水平，降低T細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境遷移的能力［7］，直接誘導(dǎo)形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境；此外，腫瘤組織往往是一個(gè)缺氧環(huán)境，在缺氧環(huán)境下，MDSCs可向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞方向分化。所形成的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞一方面表達(dá)高水平B7-H1分子，后者與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，可直接誘導(dǎo)活化T細(xì)胞凋亡［8］；另一方面腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能促進(jìn)Treg和Th17細(xì)胞增殖，間接抑制T細(xì)胞活化［9］；還有報(bào)道顯示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞有促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)耐藥和促進(jìn)新生血管形成的作用［10］。骨髓瘤組織中的破骨細(xì)胞也主要來源于腫瘤微環(huán)境中的MDSCs，參與骨髓瘤骨病的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖［11］。

機(jī)體在健康狀態(tài)下，MDSCs主要存在于骨髓中，并能夠較快的分化為成熟粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。但是腫瘤情況下，該細(xì)胞的整個(gè)分化過程受阻，在外周血、脾以及炎癥組織中大量增殖，并發(fā)揮免疫抑制功能［12］。其中，M-MDSCs是發(fā)揮免疫抑制作用的主要細(xì)胞群，它分泌的細(xì)胞因子可募集高水平的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答［13］。MDSC水平與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，而系統(tǒng)性慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生和生長中發(fā)揮作用，并在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，其中中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（NLR）已被報(bào)道為最好的標(biāo)志物之一［14］，提示血液循環(huán)池的MDSC水平可以提示疾病的動(dòng)態(tài)變化和預(yù)后的預(yù)測。

通過比較不同來源MDSCs的分選發(fā)現(xiàn)外周血標(biāo)本分群較為理想；骨髓組織標(biāo)本G-MDSCs占比大，其中混雜大量早期粒細(xì)胞的干擾，不同樣本之間G-MDSCs差異小，不利于分析。因此，本研究發(fā)現(xiàn)MM患者外周血來源較骨髓組織來源MDSCs檢測更具診斷價(jià)值，為后續(xù)開展MDSCs與骨髓瘤臨床治療效果的關(guān)聯(lián)性及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的變化趨勢研究奠定了基礎(chǔ)。