下調lncRNA HCG18靶向調控miR-34a影響口腔鱗癌SCC4細胞增殖、侵襲以及遷移的分子機制

丁延晶 王立新 邱靜怡 余日月

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200 nt的非編碼RNA，其最初被人們認為沒有生物學作用，后續研究發現，lncRNA參與調控基因印記、mRNA剪切、表觀遺傳學等過程，并且通過對基因多方面調控影響細胞的生長、轉移［1］。研究表明，lncRNA與腫瘤的進展有關，其異常表達往往與腫瘤轉移程度等具有密切關系［2］。lncRNA人類白細胞抗原復合體18（human leucocyte antigen complex group 18，HCG18）與多種疾病的病理進程有關［3］。HCG18在非小細胞肺癌等腫瘤中高表達，HCG18表達上調與腫瘤患者的預后和轉移有關，下調HCG18可以抑制腫瘤的細胞惡性增殖和轉移［4］。miR-34a是近些年來備受關注的miR-34家族成員，其在肝癌、口腔癌等腫瘤中表達下調，上調其表達可以抑制腫瘤細胞惡性表型［5］。通過細胞轉染的方法下調細胞中HCG18表達，探討下調HCG18對口腔鱗癌細胞增殖和遷移的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

口腔鱗癌CAL27、HB96細胞購自上海慧穎生物科技有限公司；miR-34a inhibitor、inhibitor control、HCG18 shRNA、HCG18 shRNA、miR-34a mimics、mimics control均由上海吉瑪制藥技術有限公司構建合成；口腔鱗癌SCC4、HB96細胞購自上海美軒生物科技有限公司；N-cadherin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology：正常口腔黏膜（Normal Oral Keratinocyte，NOK）細胞購自上海艾研生物科技有限公司；E-cadherin抗體購自美國Proteintech Group；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 HCG18在口腔鱗癌細胞中的表達檢測

采用Realtime PCR方法測定，步驟如下：收集口腔鱗癌CAL27、SCC4、HB96細胞和正常口腔黏膜NOK細胞，提取細胞總RNA，提取方法按照Trizol操作說明進行。逆轉錄反應體系為：1μL的RT Enzyme Mix I、1μL的Random 6 mers、4μL的5×Prime Script Buffer、1μL的Oligo dT Primer，最后添加RNase-free H2O至20μL。收集cDNA，用SYBR進行PCR反應，PCR反應程序為：預變性（95℃30 s），變性（95℃5 s），退火延伸（60℃60 s），一共40個循環。結果按照2-△△Ct法計算。

1.3 細胞轉染及下調效果測定

按照Lipofectamine 2000轉染試劑進行細胞轉染。把轉染HCG18 shRNA和shRNA control的細胞設置為sh-HCG18和sh-NC組，把沒有轉染的細胞設置為Control組。細胞轉染后48 h，用Realtime PCR方法測定HCG18表達，步驟同1.2。

1.4 下調HCG18對口腔鱗癌細胞增殖影響檢測

采用噻唑藍（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）方法測定。

1.5 下調HCG18對口腔鱗癌細胞遷移和侵襲影響檢測

采用Transwell小室測定，侵襲實驗前用基質膠包被，遷移實驗前省略包被步驟，其余步驟相同，簡述如下：以不含血清的細胞培養液將Control、sh-NC、sh-HCG18組細胞懸浮，然后吸取200 μL的細胞種植到小室的上室中，同時在下室中加入500μL的含血清細胞培養液，放在37℃的CO2培養箱中培養24 h。甲醇固定，結晶紫染色。放在顯微鏡下隨機選取5個視野計數細胞穿膜數目，結果取平均值即為細胞侵襲或遷移數目。

1.6 下調HCG18對口腔鱗癌細胞中N-cadherin、E-cadherin蛋白表達影響檢測

采用Western blot方法測定，步驟簡述如下：提取Control、sh-NC、sh-HCG18組細胞總蛋白，每個孔內蛋白上樣量均為40μg；電泳電壓為90 V恒壓電泳0.5 h，然后以120 V恒壓電泳2 h。將NC膜裁剪成與分離膠大小相同，在60 V恒壓條件下轉膜，轉膜裝置在4℃條件下進行，轉膜時間設置為60 min。5%脫脂奶粉的封閉；一抗結合過夜；二抗孵育2 h。以電化學發光（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）方法顯色。結果用mage J分析條帶的OD值，把GAPDH作為內參。

1.7 HCG18靶基因預測以及鑒定

生物信息學軟件（starbase）預測HCG18的靶基因，發現miR-34a與HCG18有互補結合位點。用熒光素酶報告系統鑒定靶向關系。分別將野生型（WT）和突變型（MUT）HCG18熒光素酶報告載體與miR-34a mimics和mimics control共轉染到口腔鱗癌細胞中，48 h后，檢測其熒光素酶活性變化。WT和MUT熒光素酶報告載體均由湖南豐暉生物科技有限公司構建。收集Control、sh-NC、sh-HCG18組細胞，U6為內參，以Realtime PCR方法測定miR-34a表達變化，步驟同1.2。

1.8 miR-34a inhibitor對下調HCG18的口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲影響檢測

在口腔鱗癌細胞中分別共轉染miR-34a inhibitor、HCG18 shRNA和inhibitor control、HCG18 shRNA，設置為sh-HCG18+Anti-miR-34a、sh-HCG18+Anti-NC組，按照1.4、1.5、1.6中方法測定細胞增殖、遷移、侵襲以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表達變化。

1.9 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件統計分析，計量資料用（）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 口腔鱗癌細胞和正常口腔細胞中HCG18表達差異

HCG18在口腔鱗癌CAL27、SCC4、HB96細胞中的表達水平均高于正常口腔黏膜NOK細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HCG18在口腔鱗癌細胞和正常口腔黏膜細胞中HCG18表達差異比較（±s）Table 1 Comparison of HCG18 expression in oral squamous cell carcinoma cells and normal oral mucosa cells（±s）

表1 HCG18在口腔鱗癌細胞和正常口腔黏膜細胞中HCG18表達差異比較（±s）Table 1 Comparison of HCG18 expression in oral squamous cell carcinoma cells and normal oral mucosa cells（±s）

細胞NOK CAL27 HB96 SCC4 F值P值HCG18水平1.00±0.09 1.69±0.12 2.41±0.23 2.94±0.21 215.60＜0.001

圖1 Western blot測定N-cadherin、E-cadherin蛋白表達Figure 1 western blot analysis of the expression of N-cadherin and E-cadherin

2.2 HCG18 shRNA對口腔鱗癌SCC4細胞增殖、侵襲和遷移影響

轉染HCG18 shRNA后的口腔鱗癌SCC4細胞中HCG18表達水平降低，細胞增殖能力下降，細胞遷移以及侵襲數目均下降，細胞中N-cadherin蛋白表達水平下降，E-cadherin蛋白表達水平升高。見圖1和表2。

2.3 HCG18靶向調控miR-34a

生物信息學軟件預測miR-34a和HCG18結合位點，WT和miR-34a mimics共轉染后的口腔鱗癌SCC4細胞熒光素酶活性下降。見圖2和表3。HCG18靶向調控miR-34a。

表2 細胞中HCG18表達、OD值、遷移數目、侵襲數目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表達差異比較（±s）Table 2 Comparison of HCG18 expression,OD value,migration number,invasion number,N-cadherin and E-cadherin protein expression in cells（±s）

表2 細胞中HCG18表達、OD值、遷移數目、侵襲數目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表達差異比較（±s）Table 2 Comparison of HCG18 expression,OD value,migration number,invasion number,N-cadherin and E-cadherin protein expression in cells（±s）

注：與sh-NC比，*P＜0.05。

組別Control sh-NC sh-HCG18 F值P值HCG18水平1.00±0.10 0.99±0.09 0.33±0.03*209.50＜0.001 OD值0.46±0.05 0.45±0.07 0.35±0.04*11.11＜0.001遷移數目128.64±10.24 129.47±11.86 92.28±6.52*42.27＜0.001侵襲數目102.48±9.63 101.82±10.39 80.66±7.29*16.39＜0.001 N-cadherin 0.60±0.06 0.59±0.05 0.31±0.04*95.03＜0.001 E-cadherin 0.27±0.04 0.29±0.03 0.39±0.05*22.32＜0.001

圖2 miR-34a和HCG18結合位點示意圖Figure 2 Schematic diagram of predicted binding sites of miR-34a and HCG18

表3 細胞熒光素酶活性（±s）Table 3 luciferase activity of cells（±s）

表3 細胞熒光素酶活性（±s）Table 3 luciferase activity of cells（±s）

組別Mimics control miR-34a mimics t值P值MUT 1.00±0.11 1.02±0.13 0.35 0.73 WT 1.00±0.08 0.67±0.05 10.49＜0.001

2.4 下調HCG18對口腔鱗癌SCC4細胞miR-34a表達影響

轉染HCG18 shRNA后的口腔鱗癌SCC4細胞中miR-34a表達水平升高。見表4。

表4 HCG18 shRNA轉染前后口腔鱗癌SCC4細胞中miR-34a表達差異比較（±s）Table 4 Comparison of miR-34a expression in oral squamous cell carcinoma SCC4 cells before and after HCG18 shRNA transfection（±s）

表4 HCG18 shRNA轉染前后口腔鱗癌SCC4細胞中miR-34a表達差異比較（±s）Table 4 Comparison of miR-34a expression in oral squamous cell carcinoma SCC4 cells before and after HCG18 shRNA transfection（±s）

注：與sh-NC比，a P＜0.05。

組別Control sh-NC sh-HCG18 F值P值miR-34a水平1.00±0.12 0.97±0.08 1.85±0.16a 145.10＜0.001

2.5 miR-34a inhibitor對下調HCG18的口腔鱗癌SCC4細胞增殖、侵襲和遷移影響

與共轉染inhibitor control和HCG18 shRNA的細胞比較，共轉染miR-34a inhibitor和HCG18 shRNA后的口腔鱗癌SCC4細胞中miR-34a表達下調，細胞OD值、遷移數目、侵襲數目均升高，細胞中N-cadherin蛋白表達水平升高，E-cadherin蛋白表達水平下降。見圖3和表5。

圖3 Western blot檢測N-cadherin、E-cadherin蛋白表達Figure 3 Western blot analysis of the expression of N-cadherin and E-cadherin

3 討論

人類基因組中有約2%左右可以轉錄編碼蛋白質，而基因組轉錄形成的大多數RNA沒有編碼功能，成為非編碼RNA［6］。隨著研究的不斷深入，人們逐漸發現非編碼RNA在細胞生長和發育過程發揮各種不同的生物學作用［7］。lncRNA作為一種常見的非編碼RNA，其可以通過調控基因轉錄而發揮生物學作用［8］。HCG18在腫瘤中發揮類似癌基因的作用，目前已經在肺癌、肝癌等腫瘤中證實，下調HCG18可以抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力［4，9］。本次實驗結果提示HCG18在口腔鱗癌中可能發揮促進作用，這與上述研究結果一致，均說明HCG18可能是腫瘤促進因子。

惡性腫瘤向遠端轉移是腫瘤死亡率高的重要原因，腫瘤細胞從原來的位置脫落以后，通過黏附作用進入新的組織和器官［10］。EMT是指上皮細胞特征逐漸消失而表現出間質細胞特性［11］。研究顯示，腫瘤細胞EMT后轉移概率更大［12］。N-cadherin是間質細胞標志蛋白，其屬于黏附分子，參與細胞同細胞之間的動態黏附過程［13］。N-cadherin在腫瘤中發揮癌基因的作用，高表達N-cadherin可以促進腫瘤的轉移和浸潤［14］。E-cadherin是上皮細胞標志蛋白，其不僅可以保持細胞與細胞之間的完整連接，還可以抑制細胞侵襲和遷移能力，E-cadherin具有抗腫瘤進展的作用［15］。本次實驗結果表明，下調HCG18后的口腔鱗癌細胞中N-cadherin表達水平降低，E-cadherin表達水平升高，提示下調HCG18抑制口腔鱗癌細胞EMT，進一步證實了下調HCG18具有抗口腔鱗癌轉移的作用。

表5 細胞中miR-34a表達、OD值、遷移數目、侵襲數目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表達差異比較（±s）Table 5 Comparison of miR-34a expression，OD value，migration number，invasion number，N-cadherin and E-cadherin protein expression（±s）

表5 細胞中miR-34a表達、OD值、遷移數目、侵襲數目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表達差異比較（±s）Table 5 Comparison of miR-34a expression，OD value，migration number，invasion number，N-cadherin and E-cadherin protein expression（±s）

組別sh-HCG18+Anti-NC sh-HCG18+Anti-miR-34a t值P值miR-34a水平1.00±0.08 0.42±0.04 19.45＜0.001 OD值0.34±0.05 0.46±0.03 6.17＜0.001遷移數目91.32±7.59 120.48±10.67 6.68＜0.001侵襲數目82.96±5.81 99.47±9.63 4.40＜0.001 N-cadherin 0.32±0.05 0.63±0.07 10.81＜0.001 E-cadherin 0.38±0.06 0.24±0.04 5.82＜0.001

研究報道顯示，lncRNA作用機制較為復雜，其可以通過調控基因的轉錄而發揮多種生物學作用，并且同一個lncRNA可以同時調控多個靶基因［16］。本次實驗顯示，HCG18可以靶向負調控口腔鱗癌細胞中miR-34a的表達，HCG18作用機制可能與miR-34a有關。miR-34a基因定位在1p36.23染色體上，其功能缺失多見于白血病、乳腺癌等惡性腫瘤，miR-34a通過靶向調控下游基因的表達影響細胞的侵襲、遷移［17］。之前的研究表明，miR-34a可以降低口腔鱗癌細胞的侵襲和遷移能力。

綜上，下調HCG18在口腔鱗癌細胞增殖、侵襲、遷移和EMT中發揮抑制作用，其作用機制與靶向上調miR-34a的表達有關，目前對于miR-34a作用的下游機制還不明確。我們的實驗結果為靶向基因治療口腔鱗癌提供了參考，為研究HCG18在口腔鱗癌中的調控網絡提供了資料。