新型冠狀病毒數(shù)字PCR檢測方法建立

李彤 荊福祥 李宏志 邢曉星 趙金銀 程迪 曲守方 劉琦★

2019年12月我國出現(xiàn)一種不明原因的肺炎疫情，2020年1月對肺炎患者樣本進行測序，發(fā)現(xiàn)該肺炎病原體為一種先前未知的新型冠狀病毒-嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，又稱新型冠狀病毒）［1-2］。SARS-CoV-2是現(xiàn)在已知的第7種可以感染人的冠狀病毒。PENG ZHOU和J-F CHAN等［3-4］通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2全基因組水平有79.5%以上與SRAS-CoV幾乎相同，與蝙蝠冠狀病毒的同源性達96.0%，且證實與SARS-CoV相同是通過與細胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合方式進入宿主細胞［5］。新型冠狀病毒有極強傳染性和傳播力，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力等全身癥狀，伴有干咳和呼吸困難等，可迅速發(fā)展為重癥肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫綜合征等。冠狀病毒主要通過直接接觸分泌物或經(jīng)氣溶膠、飛沫傳播［6］。目前主要采用熒光定量PCR技術(shù)進行檢測，優(yōu)點是快速且檢測結(jié)果比較準確［7］。但是目前受到檢測樣品類型限制，熒光定量PCR對咽拭子樣品核酸檢測存在一定比例的假陰性，因此在實際檢測中對于病原檢測的靈敏度和特異性具有更高要求。

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數(shù)［8-9］。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度、特異性和精確性，數(shù)字PCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可。而且其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、高通量測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面也具有的廣闊應(yīng)用前景，已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注［10-12］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

樣本RNA來自3例臨床診斷為新型冠狀病毒肺炎患者核酸RNA提取樣本。人基因組RNA，來自于100個正常人的基因組RNA等體積混合而成，由大連晶泰生物技術(shù)有限公司提供。新型冠狀假病毒質(zhì)粒合成于生工生物工程（上海）股份有限公司，該假病毒質(zhì)粒含有完整的Orf1ab基因序列。

1.1.2 試劑與儀器

QIAamp Viral RNA Mini Kit購自德國QIAGEN公司；HiScript IIIReverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；QS 3D DigitalL PCR V2 MMX 1.5ML Kit和QS 3D DQPCR V2 20K CHIP購自美國賽默飛公司。新型冠狀病毒2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）購自華大生物科技（武漢）有限公司。

數(shù)字PCR儀使用Thermo Fisher公司的Quant-StudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。熒光定量PCR儀使用上海宏石公司的SLAN-96P熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計與合成

根據(jù)已公布新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的基因組序列，利用DNAStar和Primer5.0軟件設(shè)計擴增特異性引物及探針，新型冠狀病毒Orf1ab基因上游引物：1AB-F：5′-CAAGGTAAACCTTTGGAATTTG-3′；新型冠狀病毒Orf1ab基因下游引物：1AB-R：5′-TTGTCCTCACTGCCGT-3′；新型冠狀病毒Orf1ab基因探針：1AB-P：5′-FAM-TGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACC-BHQ1-3′。

根據(jù)GenBank中登陸的人基因組ACTB基因序列，利用DNAStar和Primer5.0軟件設(shè)計擴增特異性引物及探針，內(nèi)參基因ACTB上游引物：ACTB-F：5′-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3′；內(nèi)參基因ACTB下游引物：ACTB-R：5′-GTACTTCAGGGTGAGGATGC-3′；內(nèi)參基因ACTB探針：ACTB-P：5′-VICAATCCTTCTGACCCATGCCCACC-BHQ2-3′。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 數(shù)字PCR反應(yīng)體系和條件

PCR反應(yīng)為一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈擴增法（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。新型冠狀病毒Orf1ab基因上游引物、下游引物、新型冠狀病毒Orf1ab探針、ACTB內(nèi)參基因的上游引物、下游引物、ACTB內(nèi)參基因探針按照其在數(shù)字PCR體系中的濃度分別為450、450、450、450、450、225 nM的最適比例進行混合，配置成20X的引物探針混合液。PCR反應(yīng)體系為：QuantStudioTM 3D Digital PCR Master Mix v2（2×）7.3μL；新型冠狀病毒引物探針混合液（20×）0.7 μL；HiScript III Reverse Transcriptase（200 U/μL）2μL；RNA模板4.5μL。將以上配置好的體系加入到數(shù)字PCR芯片中（QμantStμdioTM 3D Digital Chip v2），并用礦物油覆蓋芯片，密封好并確保無泄漏。再把芯片放到PCR儀器（例如，ProFlex?PCR System）中，進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：50℃，50 min；96℃，10 min；57℃，2 min，98℃，30 sec，39個循環(huán)；57℃，2 min；10℃保存。使用分析軟件：QuantStudio?3D AnalysisSuite?Software對數(shù)字PCR反應(yīng)結(jié)果進行分析。

1.2.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件

熒光定量PCR檢測使用新型冠狀病毒2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），反應(yīng)體系及條件按照說明書要求設(shè)置。

1.2.4 準確性和靈敏度試驗

新型冠狀假病毒質(zhì)粒合成于上海生工生物，該假病毒質(zhì)粒含有完整的Orf1ab基因序列。將人基因組RNA、假病毒質(zhì)粒按照一定比例進行混合分別形成假病毒含量為1×105、1×104、1×103、100、50、25 copies/mL的參考品。將上述的假病毒參考品作為模板進行實驗，評價該方法的準確性和靈敏度。根據(jù)檢測拷貝數(shù)和理論拷貝數(shù)做標準曲線和線性回歸系數(shù)R2值。

1.2.5 特異性試驗

參照核酸提取試劑盒說明書方法提取豬流行性腹瀉病毒PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、風疹病毒RV、甲型流感病毒H1N1的核酸，利用建立的數(shù)字PCR檢測方法進行擴增，同時提取的健康人樣本的核酸做為陰性對照，評價該方法的特異性。

1.2.6 精密度試驗

選取50、500 copies/mL濃度水平的參考品分批次重復(fù)檢測10次，得到重復(fù)檢測結(jié)果，統(tǒng)計濃度對數(shù)值的變異系數(shù)（CV，%）。

1.2.7 數(shù)字PCR檢測方法與熒光定量PCR檢測方法對比試驗

采集確診的3例臨床新型冠狀病毒肺炎患者RNA樣本，同時利用建立的數(shù)字PCR檢測方法與新型冠狀病毒2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）進行檢測，分別得到熒光定量PCR結(jié)果和數(shù)字PCR病原體拷貝數(shù)結(jié)果。

將人基因組RNA、假病毒質(zhì)粒按照一定比例進行混合分別形成假病毒含量為500、300、150、100、75和50 copies/mL假病毒參考品。將參考品利用新型冠狀病毒2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）進行熒光定量PCR檢測，其中100、75和50 copies/mL參考品重復(fù)檢測25次。確定新型冠狀病毒2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）檢測靈敏度，將其結(jié)果與數(shù)字PCR檢測方法比較。

2 結(jié)果

2.1 準確性和靈敏度

不同含量假病毒參考品進行數(shù)字PCR檢測，根據(jù)數(shù)字PCR檢測病毒含量與理論病毒含量進行擬合，其線性回歸系數(shù)R2為0.998 8，表明在該條件下，新型冠狀假病毒的理論值病毒含量和實際檢測病毒含量呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系，顯示建立的數(shù)字PCR檢測方法具有很好的準確性。見表1。

表1 假病毒參考品準確性的數(shù)字PCR檢測結(jié)果Table 1 Results of accuracy for pseudoviral reference by digital PCR

25次重復(fù)實驗的結(jié)果為50 copies/mL的假病毒參考品23次均能準確檢出，而25 copies/mL的假病毒參考品只有3次能準確檢出。結(jié)果表明新型冠狀假病毒數(shù)字PCR檢測方法的靈敏度為50 copies/mL，見圖1。

圖1 50 copies/mL假病毒參考品數(shù)字PCR檢測結(jié)果Figure 1 Result of 50 copies/mL pseudoviral reference by digital PCR

2.2 特異性

經(jīng)序列同源性比對，所選用的引物和探針與其他的人冠狀病毒、流感病毒等呼吸道病毒無同源性。對病原體PEDV、TGEV、RV、H1N1的核酸與健康人群核酸樣本進行特異性評價，結(jié)果均為陰性，顯示較好的特異性，見圖2。

圖2 健康人群核酸樣本數(shù)字PCR檢測結(jié)果Figure 2 Result of nucleic acid samples from healthy people by digital PCR

2.3 精密度

選取濃度為50、500 copies/mL水平的參考品分批次重復(fù)檢測10次，根據(jù)檢測結(jié)果統(tǒng)計出濃度對數(shù)值的變異系數(shù)（CV，%）為5.97%和1.99%，建立的數(shù)字PCR方法有良好的精密度。

2.4 兩種檢測方法對比

采集3例臨床新型冠狀病毒肺炎患者RNA樣本，利用數(shù)字PCR檢測方法進行檢測，結(jié)果均為陽性。與國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準上市的新型冠狀病毒2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）的檢測結(jié)果進行平行比較，見表2。

表2 兩種方法檢測結(jié)果比較Table 2 Comparison results of 2 detection methods

檢測結(jié)果顯示2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）只能檢測到100 copies/mL以上病毒含量的樣本，與試劑盒說明說中標注的檢測靈敏度一致，見圖3。而數(shù)字PCR靈敏度和準確性實驗結(jié)果顯示數(shù)字PCR檢測方法的靈敏度可達到50 copies/mL，高于熒光定量PCR方法的靈敏度（100 copies/mL）。

圖3 樣本RNA-1稀釋樣本熒光定量PCR檢測結(jié)果Figure 3 Fluorescence quantitative PCR test results of RNA-1 diluted samples

3 討論

新型冠狀病毒SARS-CoV-2傳染性強，臨床癥狀不典型，給臨床診斷和疫情防控帶來很大困難，快速又精確的診斷對新冠肺炎的防控至關(guān)重要。病原學是診斷新型冠狀病毒感染的金標準，但由于其存在窗口期、靈敏度低、程序復(fù)雜等缺陷，難以在此次疫情中得到廣泛應(yīng)用，而病毒的核酸檢測也是確診COVID-9的金標準，其靈敏度更高。定量檢測可以動態(tài)檢測病毒感染的程度從而觀察療效，因此核酸檢測在COVID-9的診斷及疫情的防控中擔任不可或缺的角色。而數(shù)字PCR技術(shù)具有更高的檢測靈敏度和準確度，能夠更好的滿足臨床診斷需求。

本研究建立了一種數(shù)字PCR檢測方法，使逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增過程一步完成，減少了開蓋污染的風險。選取新型冠狀病毒SARS-CoV2的高保守區(qū)域Orf1ab基因進行引物與探針設(shè)計保證了特異性和準確性，通過實驗結(jié)果可以看出本研究建立的數(shù)字PCR檢測方法具有很好的靈敏度、準確性、特異性及臨床適用性，可以用于臨床新型冠狀病毒的快速檢測，為新型冠狀病毒感染的診斷及流行病學調(diào)查提供了有效的工具。

利用3例臨床新型冠狀病毒肺炎患者RNA樣本進行檢測，均能準確檢出，表明建立的數(shù)字PCR檢測方法具有較好的臨床適用性。與國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準上市的新型冠狀病毒2019-nCOV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）檢測結(jié)果進行平行比較，結(jié)果顯示建立的數(shù)字PCR檢測方法具有更高的靈敏度，可以改善現(xiàn)階段熒光定量PCR法檢測試劑盒的假陰性問題。