木聚糖酶基因(XynB)腸道特異表達載體的構建及鑒定

涂楓 趙為民 曹靜

摘要：將黑曲霉屬XynB基因和豬RELMβ基因核心啟動子區克隆到pcDNA3.1（-）中，構建攜帶綠色熒光和Myc雙標記的腸道特異表達載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP。利用脂質體介導將載體轉染人結腸癌細胞（HT29）和人肝癌細胞（Bel7402），熒光顯微鏡檢測發現，該載體可在HT29細胞特異表達綠色熒光蛋白;對轉染該表達載體的HT29細胞進行RT-PCR檢測和WB分析，結果表明，XynB基因在HT29細胞中正常轉錄，并且在細胞內檢測到目的蛋白表達。

關鍵詞：木聚糖酶;特異表達載體;抵抗素樣β基因;WB檢測;RT-PCR檢測

中圖分類號： Q786 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0053-04

收稿日期：2019-07-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：31872338）;國家生豬現代產業技術體系項目（編號：CARS-35）;江蘇省農業重大新品種創制項目（編號：PZCZ201733）。

作者簡介：涂楓（1989—），男，江蘇南京人，主要從事豬育種研究。E-mail：530538145@qq.com。

通信作者：陳哲，副研究員，主要從事畜禽繁殖和環境控制研究。E-mail：chenzzju@163.com。 ?木聚糖是含量僅次于纖維素的半纖維素多糖，作為玉米-豆粕型日糧中的主要抗營養因子，無法被單胃動物內源性消化酶獨立消化[1]。木聚糖酶（xylanase B，XynB）可以破壞木聚糖的大分子結構，是水解木聚糖的關鍵酶。黑曲霉屬的木聚糖酶具有良好的耐酸性，畜禽胃腸道溫度和pH值對該木聚糖酶活性影響不明顯，目前木聚糖酶被作為添加劑應用于畜禽和水產飼料生產[2]。考慮到外源性木聚糖酶降解效率和木聚糖存在的廣泛性，利用轉基因技術實現木聚糖酶在動物腸道內表達，為實現飼料中木聚糖的徹底降解提供可能。

抵抗素樣β基因（resistin-like molecule β，RELMβ）是腸道免疫保護相關的重要候選基因，在近端和遠端結腸特異性高表達[3]。本研究將黑曲霉屬XynB基因和豬RELMβ基因核心啟動子區克隆到pcDNA3.1（-）中，擬構建攜帶綠色熒光和Myc雙標記的腸道特異表達載體，旨在為木聚糖酶內源性表達提供材料，也為進一步提高飼料利用率、降低家畜糞便污染提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 pcDNA3.1（-）質粒，購于上海Invitrogen生命技術有限公司;pMD18T質粒，購于大連寶生物有限公司;pRSETA-XynB質粒，由華南農業大學動物科學學院吳珍芳教授課題組構建并惠贈，pEGFP-C3質粒和pMD18-RELMβ（-574～+215）質粒，為筆者所在實驗室保存;人結腸腺癌細胞株HT29和人肝癌細胞株Bel7402，購自凱基生物（南京）公司。

1.1.2 主要試劑和工具酶 限制性內切酶NheⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ，Prime STAR 高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Premix Taq（La Taq version 2.0）酶、DH5α感受態細胞，均購自寶生物（大連）有限公司;中量無內毒素質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、快速連接試劑盒（Liga FastTM Rapid DNA Ligation System）購自Promega公司。

轉染試劑盒LipofectamineTM LTX，購自Invitrogen公司;胰酶、PBS、DMEM（高糖）、胎牛血清（FBS）為Gibco產品;抗Myc的小鼠一抗、辣根過氧化物酶偶聯的羊抗小鼠二抗、Pro-light HRP化學發光檢測試劑，均購于天根生化公司。Western Blot相關試劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司，顯影液、定影液，購自南京思泰樂公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達載體pcDNA3.1-XynB-Myc的構建 以原核載體pRSETA-XynB為模板，根據XynB基因序列，設計PCR引物P1F/P1R（表1），其中5′端引物P1F帶有Xho Ⅰ酶切位點（CTCGAG）及其保護堿基，5′端引物P1R末端引入Myc-Tag序列，帶有Kpn Ⅰ酶切位點（GGTACC）及其保護堿基。PCR產物與pMD18T載體連接，構建克隆質粒pMD18-XynB-Myc，轉化大腸桿菌DH5α，進行藍白斑篩選，陽性質粒采用限制性內切酶酶切鑒定并送測序驗證。將pcDNA3.1（-）載體和pMD18-XynB-Myc重組質粒分別用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，純化回收載體pcDNA3.1（-）和目的片段 XynB-Myc，利用T4連接酶將純化回收后的 XynB-Myc目的片段連接到線性化的pcDNA3.1（-）載體，構建XynB真核表達載體pcDNA3.1-XynB-Myc，連接產物轉化DH5α感受態細胞，經過藍白斑篩選，挑取陽性轉化子經過LB液體培養基擴大培養后少量提取質粒，進行酶切鑒定。

1.2.2 pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP的構建 根據質粒pcDNA3.1-XynB-Myc設計PCR引物 P1F/P2R（表1），P1F引物5′端帶有酶切位點XhoⅠ，P2R引物5′端序列與GFP序列5′末端互補。PCR條件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s;30個循環;72 ℃ 10 min，擴增的XynB-Myc片段大小為682 bp。以pEGFP-C3序列為模板，設計PCR反應引物 P3F/P3R（表1），P3F的5′端序列與XynB-Myc序列3′末端一致，引物P3R的5′端帶有酶切位點Kpn Ⅰ。擴增程序：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環;72 ℃ 10 min，擴增的片段大小為768 bp。

以上述擴增產物XynB-Myc片段及GFP片段為模板，使用引物為P1F和P3R，采用重疊PCR方法將2種組件融合，獲得XynB-Myc-GFP融合片段（1 398 bp），擴增的程序：98 ℃ 4 min;98 ℃ 10 s，52 ℃ 10 s，72 ℃ 130 s，30個循環;72 ℃ 10 min。擴增的片段大小為1 398 bp。

利用T4連接酶將XynB-Myc-GFP純化后融合片段與pMD18T連接，得到中間載體pMD18T-XynB-Myc-GFP，雙酶切鑒定。采用XhoⅠ和KpnⅠ對pMD18T-XynB-Myc-GFP進行雙酶切，回收得到XynB-Myc-GFP片段，克隆至pcDNA3.1（-）相應的酶切位點，獲得重組載體pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP，并進行雙酶切鑒定。

1.2.3 豬RELMβ基因啟動子指導的腸道特異表達載體構建 利用NheⅠ和XhoⅠ對pMD18-RELMβ（-574～+215）和pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP進行雙酶切，凝膠回收目的片段，將RELMβ核心啟動子片段克隆到pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP相應的酶切位點，獲得重組載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP，酶切鑒定載體。

1.2.4 XynB在HT29細胞的特異表達 HT29細胞接種于細胞培養孔中，采用脂質體介導轉染pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP重組載體，轉染12 h后在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況并拍照。

1.2.5 XynB基因在HT29細胞中的表達鑒定 將穩定轉染重組表達載體的HT29細胞系復蘇，以培養48 h后的細胞總蛋白進行Western-blot試驗，選擇Myc抗體檢測目的蛋白XynB在細胞中的表達。收集培養4 d的轉基因HT29細胞系、同代正常培養HT29細胞和空載體轉染的HT29細胞抽提RNA，經過DNase處理后，通過RT-PCR檢測其轉錄情況，設計引物擴增XynB-GFP基因片段部分序列，跨內含子β-action內參引物檢測用于排除模板DNA污染（表1）。

2 結果與分析

2.1 真核表達載體pcDNA3.1-XynB-Myc的構建

以原核載體pRSETA-XynB為模板，PCR擴增獲得目的基因片段XynB-Myc，大小為678 bp（圖1-A）。雙酶切鑒定顯示，XynB-Myc成功連接到pMD18T載體中（圖1-B）。重組載體pcDNA3.1-XynB-Myc經雙酶切，獲得2條條帶，與預期相符（圖1-C），表明XynB-Myc成功插入到表達載體pcDNA3.1中。

2.2 載體pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP的構建

擴增的XynB-Myc片段大小為682 bp，以pEGFP-C3為模板，擴增的GFP片段大小為 768 bp，XynB-Myc片段及GFP片段為模板，重疊PCR獲得XynB-Myc-GFP融合片段，大小為 1 398 bp，酶切產物電泳檢測符合預期大小（圖2-A）。雙酶切鑒定顯示，XynB-Myc-GFP成功連接到pMD18T載體中（圖2-B）。構建的pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP表達載體XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，凝膠電泳檢測，觀察到大小符合預期的目的連接片段和空質粒片段（圖2-C），表明XynB-Myc-GFP片段成功克隆到pcDNA3.1載體。

2.3 腸道特異表達載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP構建

在前期的研究中，對豬RELMβ基因表達特性及啟動子活性進行了分析，選擇核心啟動子區域（-574～+215）作為腸道特異性啟動子，克隆至表達載體內。構建的pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP載體雙酶切后凝膠電泳檢測，觀察到大小約為2 000 bp的目的連接片段和空質粒片段，表明RELMβ啟動子片段成功插入到pcDNA3.1- XynB-Myc-GFP載體中（圖3）。

2.4 XynB在HT29細胞中的特異表達

采用脂質體法，將重組表達載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP 轉染體外培養的HT29細胞，培養12 h時，通過熒光顯微鏡可以觀察到融合表達的綠色熒光蛋白，而在Bel7402細胞轉染重組表達載體 12 h 未觀察到綠色熒光蛋白表達（圖

4）。結果表明，構建的腸道特異表達載體能夠指導XynB基因在腸道細胞特異表達。

2.5 XynB基因在HT29細胞表達鑒定

由圖5可知，轉XynB基因的HT29細胞蛋白中含有目的蛋白，大小約為50 ku，陰性對照組未檢測到目的蛋白。

提取RNA為模板，進行RT-PCR檢測，由圖6可知，轉基因HT29細胞內正常轉錄合成XynB酶mRNA序列。跨內含子引物擴增β-action基因顯示無內含子片段擴增，排除了DNA污染可能。

3 討論

天然的啟動子數量眾多且各具特點，進行基因重組體外表達研究時，研究者通常采用導入特異啟動子來實現目的基因的組織特異性表達。β-乳球

蛋白（β-lactoglobulin，BLG）是反芻動物最主要的乳清蛋白，利用BLG基因啟動子和5′端調控序列構建的融合α-抗胰蛋白酶、降鈣素和人血清白蛋白等轉基因動物均實現目的基因在乳汁的表達[4-6]，在目前科研中廣泛用來指導外源基因在乳汁中的表達。腮腺分泌蛋白（parotid secretory protein，PSP）是唾液中特異性高表達的一種蛋白，豬PSP基因是研制豬腮腺轉基因生物反應器及進行轉基因育種研究的最佳候選基因[7-8]，綿羊毛囊角蛋白關聯蛋白（keratin-associated protein 6.1，KAP6.1）基因已被證實在綿羊毛囊中特異表達[9]，針對這一特點，已用綿羊KAP6.1啟動子構建了一系列毛囊特異表達載體[10-11]。

RELMβ基因已被證實在嚙齒動物和人的腸道組織特異表達[3]。研究表明，RELMβ基因啟動子區包含多個腸上皮特異性轉錄調控因子，而啟動子區（-574～+215）片段是核心區域，包含有關鍵順式作用元件[12]。本研究構建的表達載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP在腸道特異表達啟動子RELMβ調控下，可有效指導XynB在腸細胞系HT29特異表達;下一步將利用體外細胞培養試驗，測定構建的重組載體真核表達分泌和酶活性，以及分泌的XynB酶穩定性、最適pH值等，為運用轉基因技術實現XynB內源性表達提供重要材料。

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