云南小葉種茶樹葉片和莖段愈傷組織誘導及繼代培養

亓 崢， 龐志強， 藍增全*

(1.西南林業大學生態與環境學院，昆明 650224；2.中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源可持續利用重點試驗室，昆明 650223；3.中國科學院大學，北京 100049)

云南是茶樹的起源地之一，茶樹品種資源豐富，尤其是野生資源。同時，云南也是中國產茶大省，茶葉生產在云南農業經濟中占有重要的地位[1-3]。研究表明，相較于云南大葉種茶，云南小葉種茶中胡蘿卜素和葉黃素的含量較高，可制出高香型茶，“十里香”即是典型的云南小葉種茶樹[4]。

隨著茶葉產業的發展，選育優良茶樹品種的需求也越來越迫切。但茶樹基因具有高度的雜合性，傳統的育種方法在新品種選育中較為困難[5-7]。茶樹組織培養具有培養時間短、繁殖系數大、后代可保持親本優良性狀的優點，能夠利用較少的茶樹材料、在短時間內產生較多的植株。在實際生產中具有重大的實踐意義，對于優良品種快速繁殖、新品種推廣種植、種植資源的保存具有重要的意義[8-10]。

茶樹組培過程中仍存在愈傷組織誘導率低、易褐化、難以分化、基因不能按序表達等問題[11]。目前，茶樹組織培養技術不夠成熟，尤其是在無性快繁、保存種質資源，建立外源基因轉化的受體系統等方面[12-13]，且前人在茶樹組織培養中多選用胚作為外植體材料，鮮見以茶樹葉片及莖段為外植體誘導愈傷組織的報道。

為此，通過研究不同消毒方法對云南小葉種“十里香”成活率及消毒效果的影響，獲得優質的無菌試管苗，并以無菌苗的葉片和莖段為外植體,探索不同培養基類型、激素種類及濃度配比對愈傷組織誘導的影響，以期建立穩定的愈傷快繁體系，為其他茶樹良種的推廣和繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原材料選用云南小葉種“十里香”，采自云南農業大學教學茶園。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌試管苗萌發

將茶種剝去果皮和種皮，洗凈，置于超凈工作臺中。通過4%次氯酸鈉溶液和75%酒精組合消毒方式(表1)進行外植體消毒，統計污染率和發芽率。

表1 不同茶種消毒方法Table 1 Different disinfection methods for tea seeds

1.2.2 茶樹葉片組織培養

將無菌試管茶苗葉片剪去葉邊和葉緣，剪成0.5 cm×0.5 cm方片，在葉片上沿葉脈方向劃出傷口，葉片正面向上，置于培養基上。每瓶培養基中接種5枚葉片，每種培養基處理接種20瓶(下同)，重復3次。培養過程中每5 d觀察1次，統計培養物的形態、顏色和生長情況，培養30 d，統計誘導率。通過正交試驗(MS培養基、1/2MS培養基、B5培養基與4種激素配比)獲得最適宜誘導茶樹葉片愈傷組織的配方，葉片愈傷組織誘導培養基配方如表2所示。

表2 葉片愈傷組織誘導培養基配方Table 2 Formula of leaf callus induction medium

篩選出茶樹葉片愈傷組織生長較好的培養基作為繼代培養基(表3)，將誘導出的愈傷組織用手術刀切下，置于葉片愈傷組織繼代培養基中，繼續增殖誘導，每5 d觀察1次，培養20 d，統計葉片愈傷組織增長大小及狀態。

表3 葉片愈傷組織繼代培養基配方Table 3 Formula of subculture medium for leaf callus

1.2.3 茶樹莖段組織培養

將無菌苗不帶腋芽的莖段用手術刀切成0.5 cm的小段，放置于莖段愈傷組織誘導培養基(表4)中，使有切口的兩端接觸培養基，每瓶培養基中接種5個莖段，每個處理接種20瓶(下同)。培養過程中每5 d觀察1次，統計培養物的形態、顏色和生長情況，培養30 d，統計誘導率。通過正交試驗(MS培養基、1/2 MS培養基、B5培養基與4種激素配比)獲得適宜誘導茶樹莖段愈傷組織的配方。

表4 莖段愈傷組織誘導培養基配方Table 4 Formula of callus induction medium for stem segment

篩選出茶樹莖段愈傷組織生長較好的培養基作為繼代培養基(表5)，將誘導出的愈傷組織用手術刀切下，置于莖段愈傷組織繼代培養基中，繼續增殖誘導，每5 d觀察1次，培養20 d，統計葉片愈傷組織增長大小及狀態。

表5 莖段愈傷組織繼代培養基配方Table 5 Formula of subculture medium for stem callus

1.2.4 培養條件

每升添加蔗糖30 g，瓊脂7 g，pH為5.7。在無菌培養室中培養，環境條件為(25±2) ℃，相對濕度60%～70%，避光暗培養。

1.3 數據統計與分析

外植體按上述培養方式進行接種培養，每隔5 d對愈傷組織誘導情況、增殖情況及分化情況進行觀察記載，及時清理污染的外植體，通過數據分析選擇出適宜云南小葉種茶樹葉片及莖段愈傷組織誘導的培養方案。

利用Microsoft Excel 2007處理試驗數據；SPSS 24.0進行方差分析和Duncan多重對比。

試驗主要統計指標：

(1)

(2)

(3)

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對種子萌發的影響

通過篩選，具體篩選方法見表6，確定茶樹種子適宜消毒方式，降低污染率，有利于后續試驗的進行。結果表明，使用單一消毒劑比酒精和次氯酸鈉結合使用消毒效果差。綜合污染率、成活率及時間成本，茶種最佳消毒方法為次氯酸鈉消毒10 min、酒精消毒30 s。

表6 不同消毒方法對種子萌發的影響Table 6 Effects of different disinfection methods on seed germination

當消毒試劑只有4%次氯酸鈉時，污染率隨著次氯酸鈉消毒時間的增加而降低，同時，成活率也隨著次氯酸鈉消毒時間增加而降低，說明在4%次氯酸鈉溶液中浸泡時間過長會對植物材料產生毒害作用，從而影響種子的萌發率和成活率。當添加75%酒精時，污染率呈下降的趨勢，說明75%酒精對污染控制有明顯作用，但75%酒精消毒時間對成活率并無明顯影響。

在試管苗萌發過程中，觀察到部分茶苗出現變異現象，變異形態各異，如圖1所示，具體變異原因還有待進一步考證。

圖1 種子萌發的不同狀態Fig.1 Different state of seed germination

2.2 葉片愈傷組織誘導及繼代培養

葉片愈傷組織誘導試驗使用12種培養基，在含有不同植物生長調節劑的1/2MS、MS和B5培養基上培養30 d，統計愈傷組織誘導率，有8種培養基可使葉片愈傷組織誘導率達到50%以上。在9號、10號、11號、12號培養基中，葉片愈傷組織誘導率達到85%以上。綜合出愈率、生長狀況以及方差分析結果，得出適宜誘導葉片愈傷組織培養基的配方是 B5+0.5 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.1 mg/L 激動素(KT)，誘導率達到97.67%。由表7可知，B5培養基對葉片愈傷組織的誘導影響顯著，以B5培養基為基本培養基的愈傷組織誘導率均在85%以上。而以1/2MS培養基為基本培養基的愈傷組織誘導率不理想，誘導率最低時僅為24.33%。

表7 葉片愈傷組織誘導結果分析Table 7 Analysis of callus induction from leaves

不同激素濃度配比也會影響出愈率和愈傷組織的生長狀況。在1/2MS培養基中，愈傷組織誘導率隨著KT濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，KT濃度為0.1 mg/L和0.5 mg/L時，愈傷組織呈現黃褐色，生長狀況不佳且出愈率較低，僅為20%～30%；MS基本培養基中，愈傷組織生長狀況明顯優于1/2MS培養基，愈傷組織誘導率隨著KT濃度的變化不規律，其中，0.5 mg/L激動素(KT)出愈率最高，且愈傷組織色澤嫩黃，質量較好(表7)，生長狀況如圖2所示。B5培養基中質0.1 mg/L激動素(KT)的葉片出愈率最高，隨著KT濃度的升高，愈傷組織誘導率逐漸下降，死亡率上升。

圖2 不同培養基誘導葉片愈傷組織生長狀況Fig. 2 Growth of leaf callus induced by different mediums

葉片愈傷組織繼代培養試驗采用6種培養基，在含有不同植物生長調節劑的1/2MS、MS和B5培養基上培養20 d后進行統計。由表8可知，3種基本培養基均可使愈傷組織增殖，但增殖效果有差別。統計結果表明，長勢最好的培養基為5號培養基，色澤嫩黃，質地疏松，呈顆粒狀，長勢較好。長勢最差的是2號培養基，顏色呈黃褐色，質地緊實，長勢較差。生長狀況如圖3所示。綜合增殖率和愈傷組織生長狀況，故適宜云南小葉種茶葉片愈傷組織繼代培養基的配方是B5+0.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L激動素(KT)，與上述適宜誘導葉片愈傷組織的培養基配方相同。同時，綜合分析試驗數據發現，在3種基本培養基中，KT濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織增殖率較低，且增殖愈傷組織質地緊實，生長狀態相對較差。

表8 葉片愈傷組織繼代培養結果分析Table 8 Analysis of subculture result of leaf callus

圖3 不同培養基繼代葉片愈傷組織生長狀況Fig.3 Growth of callus in leaves subcultured on different mediums

2.3 莖段愈傷組織誘導及繼代培養

莖段愈傷組織誘導試驗使用12種培養基，在含有不同植物生長調節劑的1/2MS、MS和B5培養基上培養30 d，統計愈傷組織誘導率，有4種培養基可使莖段愈傷組織誘導率達到80%以上。在其中8號中，莖段愈傷組織誘導率達到了93%。綜合出愈率、生長狀況以及方差分析結果，得出適宜誘導莖段愈傷組織的培養基配方是MS+1.5 mg/L 6-芐基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)+0.2 mg/L萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid，NAA)，且誘導出的愈傷組織質地疏松，呈現嫩綠色，增殖速度較快。

由表9可知，在1/2MS培養基中，愈傷組織誘導率出現隨著NAA濃度的升高而升高的趨勢，NAA濃度為0.1 mg/L時，愈傷組織呈現嫩白色(圖4)，生長狀況不佳且出愈率較低，僅為35%；MS基本培養基中，愈傷組織生長狀況優于1/2MS和B5培養基，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織誘導率逐漸升高，NAA濃度為0.5 mg/L時出愈率最高，且愈傷組織色澤嫩綠，質量較好；B5培養基中，KT濃度為0.1 mg/L時葉片的出愈率最高，隨著KT濃度的升高，愈傷組織誘導率呈下降的趨勢。

表9 莖段愈傷組織誘導結果分析Table 9 Analysis of Callus Induction from Stem Segment

圖4 不同培養基誘導莖段愈傷組織生長狀況Fig. 4 Growth of callus in stem segments induced by different media

莖段愈傷組織繼代培養試驗使用6種培養基，在含有不同植物生長調節劑的1/2MS、MS和B5培養基上培養20 d后進行統計。3種基本培養基均可使愈傷組織增殖，但增殖效果有差別。統計結果(表10)表明，長勢最好的培養基為4號培養基，色澤嫩綠，質地疏松，呈顆粒狀，長勢較好。長勢最差的是1號培養基，顏色呈嫩白色，質地緊實，長勢較差。由此分析可知，云南小葉種茶莖段愈傷組織繼代培養基最佳配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，與上述適宜誘導莖段愈傷組織的培養基配方也相同。

表10 莖段愈傷組織繼代培養結果分析Table 10 Analysis of subculture result of stem callus

3 討論

培養無菌苗是實現遺傳轉化方面分子生物學育種的基礎，通過種子萌發培育試管苗是常用的技術路線。外植體表面污物和內生菌、消毒方法不當、外植體取材時間和部位等均可引起污染[14-15]。目前，常用的消毒劑有75%酒精、0.1%升汞、次氯酸鈉(2%～5%)和抗生素類殺菌劑等，且使用聯合消毒劑能有效降低污染率。但部分消毒劑如升汞，在消毒中會有殘留，對植物材料有毒害作用，且會污染環境。研究發現在花梨木莖段消毒[16]和蘋果葉片消毒[17]中，使用次氯酸鈉消毒的褐化率較升汞低，且成活率較高。研究結果表明,適宜用于云南小葉種茶樹“十里香”種子消毒的組合為4%次氯酸鈉消毒10 min+75%酒精消毒30 s。次氯酸鈉消毒時間長，主要是由于種子較硬且表面污物較多。

培養基種類、激素種類及配比對愈傷組織誘導影響很大，在使用中需要具體探討[18-21]。研究發現在葉片愈傷組織誘導試驗中，在接種15 d后葉片開始膨大，葉緣隆起，葉片周圍開始出現黃白色愈傷組織，25 d后愈傷組織逐漸膨大，30 d后不同培養基上外植體的出愈率以及愈傷組織的生長狀況出現了明顯差別，以B5為基本培養基誘導出的愈傷組織比以1/2MS、MS為基本培養基誘導出的質量好，愈傷組織呈現嫩黃色、質地緊實，且出愈率達到97.67%。B5+0.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT適宜作為云南小葉種茶樹葉片的誘導培養基，誘導出的愈傷組織嫩黃致密，且不易褐化。在莖段愈傷組織誘導試驗中，適宜的配方是MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。研究發現，相較于1/2MS和B5培養基，MS基本培養基更適宜于茶樹莖段愈傷組織的誘導。適宜葉片愈傷組織誘導的基本培養基是B5，而適宜莖段愈傷組織誘導的基本培養基是MS，這可能是與MS和B5培養基成分不同有關，MS培養的無機鹽離子濃度較高，而B5培養基無機鹽濃度較低。相對于MS培養基，B5培養基銨的濃度更低，而銨可能對有些培養基有抑制生長的作用[22-24]。也可能因為葉片和莖段的內源激素水平不同，對外源激素的敏感度不同，培養結果也不同[25-26]。同時，在對比相同基本培養基、不同激素配比的愈傷組織誘導情況發現，適宜激素質量濃度對愈傷組織誘導效果較好，過低或過高質量濃度都會使出愈率下降，且愈傷組織長勢較差，后期易褐化。這與白芝蘭等[27]的研究結果相似。在今后試驗中可以嘗試對不同種類和質量濃度生長素和細胞分裂素進行組合，研究其對云南小葉種茶樹愈傷組織增殖和分化的影響。

不同生長素和細胞分裂素配比、不同基本培養基都會對愈傷組織的增殖產生直接影響[28-29]。適宜葉片愈傷組織增殖的繼代培養基配方與葉片誘導培養基的配方一致：B5+0.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L激動素(KT)；同樣，在莖段愈傷組織繼代試驗中發現，適宜增殖的繼代培養基配方也與莖段愈傷組織誘導培養基配方相同：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。不同細胞分裂素對愈傷組織增殖的影響也不同，葉片繼代培養基使用KT，愈傷組織呈現嫩黃色，質地疏松；莖段繼代培養基使用6-BA，愈傷組織呈嫩綠色，質地致密。試驗中還發現，經過轉瓶后，部分愈傷組織容易褐化，在后續試驗中，可以研究不同抗褐化劑對愈傷組織褐化的抑制作用。同時，對比茶樹葉片和莖段的愈傷組織生長狀況發現，葉片愈傷組織生長狀態更佳，且質地疏松，因此茶樹葉片更適宜作為建立茶樹細胞懸浮系的外植體。而關于云南小葉種茶樹葉片和莖段愈傷組織分化，還有待進一步研究。

4 結論

以云南小葉種茶樹“十里香”種子為外植體，經消毒處理后培育出無菌試管苗。基于無菌試管苗的葉片和莖段進行愈傷組織的誘導和增殖，以期為云南小葉種茶樹組織培養及遺傳轉化體系的建立提供參考，也為云南小葉種茶樹的進一步研究奠定了基礎。試驗成功誘導出質量較優且生長狀態良好的愈傷組織，但在后續試驗中，要繼續研究如何克服培養中后期褐化問題，誘導愈傷組織分化不定芽以及不定芽生根和移栽需要進行試驗研究。