瑪瑙紅櫻桃病毒病小RNA的高通量測序檢測

洪 怡， 文 壯， 田 田， 文曉鵬

(貴州大學 農業生物工程研究院/生命科學學院，山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

植物病毒病又稱為植物癌癥，給農作物和經濟作物帶來嚴重危害，使作物產量減少、品質變劣，每年在全球造成的經濟損失達200 億美元[1]。病毒病是嚴重危害到櫻桃生產的重要病害，侵染櫻屬病毒主要有 68種，侵染大櫻桃的病毒約有 34 種，較常見主要有 20 種[2]。目前有關櫻桃病毒病的研究多側重于大櫻桃病毒病相關研究，我國已發現的大櫻桃病毒病病原有櫻桃病毒 A (CherryvirusA,CVA)、櫻桃綠斑駁病毒 (Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)、櫻桃小果病毒 1 (Littlecherryvirus1,LChV-1)、櫻桃小果病毒 2 (Littlecherryvirus2,LChV-2)、李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒 (Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus,PBNSPaV)、李屬壞死環斑病毒 (Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV)、李矮縮病毒 (Prunedwarfvirus,PDV) 和黃瓜花葉病毒 (Cucumbermosaicvirus,CMV) 等[3-5]。趙慧等[6]在用于砧木使用的中國櫻桃實生苗上檢測出李屬壞死斑病毒、櫻桃綠環斑駁病毒、蘋果褪綠葉斑病毒、櫻桃壞死銹斑病毒(cherrynecroticrustymottlevirus,CNRMV)和櫻桃小果病毒 2。瑪瑙紅櫻桃(Prunuspseudoceresus‘Manaohong’)是貴州省經多年選育而成的地方優良品種[7-8]，經過20余年的推廣，目前是貴州省種植面積最大的櫻桃品種。瑪瑙紅櫻桃營養豐富，成熟期早，市場價格高，在貴州脫貧攻堅、生態文明建設、農業供給側結構性改革、增加農民收入等方面發揮了重要作用，具有較高的社會及經濟效益。在種植過程中發現，瑪瑙紅櫻桃出現大面積葉片黃化的疑似病毒侵染癥狀，甚至導致樹體死亡，嚴重影響其產量及質量。檢測瑪瑙紅櫻桃病毒病，對了解病毒病發病情況及防治和控制病毒病具有重要意義。

檢測植物病毒的傳統方法有血清學檢測、電子顯微鏡觀察、指示植物接種和基因芯片等，若是未知病原物，則耗時長、效率低下，而且容易出現檢測誤差等問題[9-11]。隨著基因測序技術的不斷發展，高通量小 RNA 測序技術開始進入植物病毒檢測領域。植物在受到病毒侵染時會形成干擾小 RNA，干擾小 RNA 作為一種防御機制，廣泛存在于植物對抗各種病原物侵染的過程中，若植物被病毒感染，在高通量測序中獲得的小 RNA 序列庫中就會含有來源于病毒的序列，通過比對分析就能得到病毒相關序列[12-13]。高通量測序技術因其快速、靈敏的檢測特點已經成為植物病毒學研究的有力工具，是一種廣譜性的病毒檢測手段，可檢測到未知病毒。VERBEEK 等[14]于2011年通過高通量測序在荷蘭種植的萵苣上檢測到1種新病毒，這種病毒導致萵苣葉基部壞死并伴隨葉卷曲。小 RNA 的高通量測序可在病原物侵染早期進行快速準確的檢測，即在植物被感染早期，還未出現明顯癥狀之前就可檢測到病原物的存在，為后續的病原物防治爭取時間[15]。目前，鮮見對貴州櫻桃瑪瑙紅病毒病的研究報道，故采用高通量技術分析瑪瑙紅櫻桃可能攜帶的病毒病種類，以期為瑪瑙紅櫻桃病毒病的防治與控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

瑪瑙紅櫻桃葉片，采自貴州省福泉市黃絲鎮、畢節市納雍縣、六盤水市六枝特區的瑪瑙紅櫻桃種植園。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理及小RNA測序 分別采集納雍(NY)、福泉(FQ)、六枝(LZ)3個地區櫻桃葉片，每個采樣點分別選取 2個試驗樣品，采集時間為 6月，選取黃化葉片(參照圖1進行選取)，液氮快速處理后帶回實驗室，置于干冰中，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行總RNA 的提取及質檢、文庫構建和高通量測序等，測序平臺為Illumiina Hiseq 2500。

1.2.2 測序數據過濾及18～26 nt小RNA篩選 對原始數據經過過濾，去掉低質量、接頭和過長片段，并去掉 3’接頭后長度小于 18 nt和大于 26 nt的片段數，獲得 clean reads片段。由于病毒感染的植物，富集的病毒小RNA長度主要分為3類：21 nt，22 nt和24 nt[16]，因此從clean reads中篩選長度 18～26 nt 的sRNA進行后續分析。

1.2.3 樣品病毒分析 使用 Velvet(參數 K-mer17)對篩選所得的小 RNA進行序列拼接，獲得較長的重疊群(contigs)。將拼接所得的contigs與寄主基因組數據庫進行比對，除去寄主基因組序列；將剩余的重疊群用 blastn與核酸數據庫進行比對，尋找與這些重疊群高度同源的序列；用 blastx將沒有找到高度同源序列的 contigs與蛋白質數據庫進行比對，尋找與 contigs部分同源的序列；將contigs高度同源序列和部分同源序列分別與病毒核酸數據庫和病毒蛋白數據庫進行比對，篩選出與病毒序列同源的 contigs；為評估該候選病毒的有效性，用 bowtie 將過濾后的小 RNA(允許1 mismatch)，與 GenBank Virus RefSeq中NY 篩選出的候選病毒核酸序列組成的數據庫進行比對，并將小 RNA 進一步定位到該數據庫中，鑒定出病毒小 RNA。

2 結果與分析

2.1 櫻桃葉片小RNA的高通量測序數據質量

2.1.1 小RNA測序數據質量 從表1可知，納雍、福泉、六枝3個文庫分別獲得21 203 575條、33 782 705條和324 192 271條原始讀數(raw reads)，去除低質量、污染讀數后，最終獲得2 063 199條、32 772 749條和31 642 051條干凈讀數(clean reads)，其 clean reads 比例均達95% 以上，滿足后續生物信息學分析要求。

表1 櫻桃葉片小RNA的高通量測序數據質量統計

2.1.2 18～26 nt小RNA條數 從表2可知，納雍、福泉和六枝樣品獲得長度介于18 ～ 26 nt的 小 RNA分別為17 645 715 條、25 667 682條和28 004 194條。從測序獲得的小 RNA 長度看，小 RNA 長度主要在 21～24 nt，尤其以 21 nt 和 24 nt 占比較高(圖2)，納雍、福泉、六枝樣品的 21 nt小 RNA分別占篩選出小 RNA的 20.92%、21.07%和23.39%，24 nt小 RNA分別占 48.57%、39.63%和45.10%。

表2 櫻桃葉片18～26 nt小RNA的條數

2.2 櫻桃葉片小 RNA的拼接與注釋

從表3可知，對篩選所得18～26 nt的小 RNA進行拼接，納雍、福泉和六枝分別獲得 4 514條、5 959條和 7 046條contigs。納雍樣本在病毒核酸、蛋白數據庫中注釋到的contigs 最多，分別有11條和40 條，福泉樣品被病毒核酸、蛋白數據庫注釋到的contigs 分別有1條 和 19 條，六枝樣品被病毒核酸、蛋白數據庫注釋到的contigs 分別有 2條 和 17 條。

表3 櫻桃葉片小RNA在數據庫的 contig 注釋數量

2.3 候選病毒

從表4可知，納雍樣本中鑒定到 5 種候選病毒，其中與 Little cherry virus 2 同源的 contigs 最多，為49條；其次與急球藻噬菌體(Synechococcusphage) 和西部云杉色卷蛾顆粒病毒(Choristoneuraoccidentalisgranulovirus) 同源的 contigs分別為 5條和 2條；檢測到與甘薯桿狀DNA病毒B(SweetpotatobadnavirusB)、花椰菜花葉病毒(Cassavaveinmosaicvirus)同源的 contigs 均為1條。福泉樣本中檢測到的主要病毒包括Synechococcusphage、SweetpotatobadnavirusB、Choristoneuraoccidentalisgranulovirus和花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus)等 6 種，以Synechococcusphage和SweetpotatobadnavirusB同源的 contigs 較高，分別為 7條 和 3條。六枝樣本中檢測到的病毒Synechococcusphage和Cauliflowermosaicvirus同源的 contigs 分別為 8條 和 2條，其余與候選病毒同源的 contigs 均為 1條。

表4 櫻桃葉片檢測病毒的類別

通過對 3個采樣地的樣本候選病毒的初步篩選，納雍樣本中鑒定到的櫻桃小果病毒 2可能為櫻桃葉片中的主要病毒，其余2組樣本中鑒定的主要病毒為噬菌體或者昆蟲病毒，含有少量的植物病毒。通過對候選病毒的有效性評估、鑒定，在納雍樣本中的候選病毒庫中，櫻桃小果病毒 2比對到的 reads 有6 014條，占總參考序列 mapped reads的75.62%，說明篩選候選病毒有效，納雍樣本中包含的病毒主要為櫻桃小果病毒 2(表 5)。

表5 納雍樣本候選病毒的有效性評估

3 結論與討論

經檢測鑒定，貴州省瑪瑙紅櫻桃納雍樣本中的候選病毒庫中，櫻桃小果病毒 2比對到的 reads 有 6 014條，占總參考序列 mapped reads的75.62%，存在病毒病。納雍縣瑪瑙紅櫻桃產區主要存在櫻桃小果病毒 2，其余部分產區櫻桃黃化癥狀并非由病毒引起。

常規的病毒檢測方法電鏡法、酶聯免疫法 (ELISA) 、聚合酶鏈式反應法 (PCR)等，都有一定的局限性，如只適用于研究比較清楚的病毒，針對性強，對于新病毒的發現較困難，且易漏檢。與傳統方法相比，高通量小 RNA測序檢測病毒病是利用植物抗病毒機制建立的一種檢測手段，對小 RNA進行高通量測序，然后組裝總小 RNA來檢測病毒，能同時鑒定樣品中存在的所有病毒，高通量測序技術在病毒的發現與鑒定研究中發揮了巨大優勢[17-18]，能夠快速地檢測樣品中存在的所有病毒，具有更高的靈敏度和信噪比，并且檢測結果不存在假陽性。隨著測序成本的不斷降低，基于小 RNA深度測序技術逐漸成為檢測植物病毒最準確、最常用的方法[19]。研究利用小 RNA測序及組裝技術在瑪瑙紅櫻桃上檢測到8種候選病毒，其中，櫻桃小果病毒 2為主要病毒，且候選病毒的有效性評估也證明了主要病毒為櫻桃小果病毒2，櫻桃小果病毒 2屬于長線型病毒科葡萄卷葉病毒屬，僅感染李屬植物，傳染性強，可引起果實變小，不能成熟等，嚴重影響櫻桃的商品價值[20]。

在此次檢測中，在納雍主產區檢測出櫻桃小果病毒 2，其他 2個產區未檢出，推測櫻桃小果病毒 2還未在全省大面積傳播，部分地區瑪瑙紅櫻桃的黃化現象應是由其他原因導致。納雍是瑪瑙紅櫻桃的發源地，許多苗木都出自納雍，雖然目前病毒病還未大范圍傳播，但櫻桃小果病毒 2致病性強，傳播快，若不及時防控，將會給貴州的瑪瑙紅櫻桃產業帶了巨大打擊，相關部門應引起重視。