白及疫病防治藥劑的篩選

何永林，霍 行，黎起秦，林緯，周瓊，袁高慶*

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004； 2.南寧市綠化工程管理中心， 廣西 南寧 530011)

白及(Bletillastriata)又名“白芨”，為蘭科白及屬多年生草本植物。白及作為一種傳統(tǒng)中藥，具有多種藥用成分和藥理活性[1]。隨著白及規(guī)模化人工種植面積的逐步擴(kuò)大，白及病害逐漸增多。近幾年，在廣西桂林市資源縣和南寧市白及種植基地發(fā)現(xiàn)，由煙草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)引起的白及疫病，危害葉片和近地面葉鞘，嚴(yán)重時(shí)致多張葉片枯死，部分田塊植株發(fā)病率為10%～38%，對(duì)白及生產(chǎn)影響較大[2]。條件合適時(shí)白及疫病在田間蔓延速度很快，需要及時(shí)使用有效藥劑進(jìn)行控制。白及病害有根腐病(Fusariumoxysporum和F.solani)、塊莖腐爛病(Rhizoctoniasolani)、葉褐斑病(Fusariumavenaceum)、灰霉病(Botrytiscinerea)、銹病(Coleosporiumbletilla)及葉斑病(Daldiniaconsentrica)[3]，尚未見有其他關(guān)于白及疫病以及防治方面的研究。已知引起白及疫病的煙草疫霉菌還可危害多種植物，其中以煙草黑脛病的研究報(bào)道居多。生產(chǎn)上防治煙草黑脛病的常用藥劑有甲霜靈和烯酰嗎啉，但近年來該病原菌已對(duì)其產(chǎn)生抗藥性[4-5]。程?hào)|美等[6]發(fā)現(xiàn)，雙炔酰菌胺、霜脲·錳鋅、精甲霜·錳鋅和噁霜·錳鋅等藥劑對(duì)煙草疫霉菌具有較好的抑菌效果，EC50在0.1～8.0 mg/L。烯酰·吡唑酯、氟菌·霜霉威和申嗪霉素對(duì)煙草黑脛病的防治效果達(dá)81.50%～91.43%，同時(shí)對(duì)煙株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，可作為甲霜靈和烯酰嗎啉的替代藥劑[7-9]。霍行[10]研究白及疫病的病原菌及防治藥劑發(fā)現(xiàn)，煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)是引起廣西當(dāng)?shù)匕准耙卟〉牟≡行舛?.1 μg/mL的氟噻唑吡乙酮對(duì)病原菌的抑菌率達(dá)100%，有效濃度10 μg/mL的噁霜·錳鋅、氟菌·霜霉威、烯酰嗎啉·嘧菌酯、申嗪霉素和雙炔酰菌胺等5種藥劑對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)有較好的抑制作用；氟噻唑吡乙酮對(duì)白及疫病病原菌的毒力作用最強(qiáng)，其EC50為0.014 2 μg/mL；盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，10%氟噻唑吡乙酮可分散油懸浮劑制劑量1.8 μL/m2的防治效果達(dá)72.05%。雖然對(duì)煙草疫霉菌所致其他植物病害有藥劑防治的研究，但同種病原菌不同來源的菌株對(duì)藥劑的敏感性可能存在差異，同種藥劑對(duì)不同植物上的同類型病害也可能具有不同的防治效果。鑒于此，該研究以17種藥劑為研究對(duì)象，采用菌絲生長(zhǎng)抑制法與室內(nèi)毒力測(cè)定、盆栽藥效試驗(yàn)相結(jié)合的方法，篩選對(duì)白及疫病有效的殺菌劑及其適宜使用濃度，以期為田間白及疫病防治的藥劑選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 白及疫病病原菌株煙草疫霉菌(P.nicotianae)，廣西大學(xué)植物病理研究室提供。

1.1.2 白及品種 紫花大白及3葉期幼苗，由廣西藥用植物園提供。

1.1.3 供試藥劑 22.5%啶氧菌酯SC，美國(guó)杜邦公司；40%嘧霉胺SC，江蘇耘農(nóng)化工有限公司；29%吡唑萘菌胺SC，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；40%噻呋酰胺SC，濟(jì)南中科綠色生物工程有限公司；20%噻菌銅SC，浙江龍灣化工有限公司；30%吡唑醚菌酯SC，濟(jì)南中科綠色生物工程有限公司；500 g/L抑霉唑EC，一帆生物科技集團(tuán)有限公司；30%丙硫菌唑OD，安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司；64%噁霜·錳鋅WP，先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司；200 g/L氟唑菌酰羥胺SC，瑞士先正達(dá)公司；25%嘧菌酯SC，山東青島凱源祥化工有限公司；68%精甲霜·錳鋅WP，先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司；94%氟嘧菌酯TC，德國(guó)拜耳作物科學(xué)有限公司；10%氟噻唑吡乙酮OD，美國(guó)杜邦公司；1%申嗪霉素SC，上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司；687.5 g/L氟菌·霜霉威SC，拜耳作物科學(xué)(中國(guó))有限公司；50%烯酰嗎·啉嘧菌酯WP，湖南農(nóng)大海特農(nóng)化有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 白及疫病病原菌株的分離培養(yǎng)。2017年從廣西桂林市資源縣梅溪鎮(zhèn)咸水口村白及種植基地采集表現(xiàn)典型癥狀的白及疫病病株，經(jīng)分離、純化及鑒定后獲得目的菌株，菌株接種于V8斜面試管中25℃下保存，菌種貯藏在廣西大學(xué)植物病理研究室。用滅菌接種針將保存的菌種移到V8(V8蔬菜汁200 mL，CaCO33 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 7)平板上，25℃下恒溫培養(yǎng)4 d后備用。

2) 白及栽培。將白及幼苗移栽于基質(zhì)土中，置于28℃大棚，定期澆水，保持土壤濕潤(rùn)。待白及長(zhǎng)至4～6片葉時(shí)用于藥劑盆栽防治試驗(yàn)。

1.2.2 殺菌劑的室內(nèi)篩選 采用生長(zhǎng)速率法[4,10]測(cè)定17種殺菌劑對(duì)白及疫病病原菌的抑制作用。采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素1為17種藥劑；因素2為藥劑濃度，每種藥劑設(shè)置2個(gè)濃度，即10 μg/mL和1 μg/mL。在V8培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的17種殺菌劑混合制成含藥培養(yǎng)基平板，以添加等量無菌水的V8培養(yǎng)基為對(duì)照，各3次重復(fù)。用打孔器在供試菌株菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將其接種到含藥平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)4 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(mm)，取其平均值，計(jì)算各藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5)]×100%

1.2.3 殺菌劑的毒力測(cè)定 從1.2.2的試驗(yàn)結(jié)果中選取對(duì)白及疫病病原菌生長(zhǎng)抑制率為100%的殺菌劑及生產(chǎn)上防治疫病常用的噁霜·錳鋅和精甲霜·錳鋅進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。各殺菌劑分別配置5個(gè)濃度，3次重復(fù)，以添加等量滅菌水為空白對(duì)照，參照上述方法測(cè)定不同藥劑各濃度對(duì)病原菌的抑制率。將藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(x)，菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成抑制機(jī)率值(y)，計(jì)算各藥劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)及抑制中濃度(EC50)。測(cè)定4種殺菌劑在EC50下對(duì)白及疫病病原菌孢子囊的影響。方法同上，3次重復(fù)，以添加等量無菌水為空白對(duì)照。菌餅接種到含藥平板在28℃下恒溫培養(yǎng)7 d后，挑取大小5 mm×5 mm帶菌培養(yǎng)基塊置于載玻片上，用蓋玻片輕輕壓散培養(yǎng)基塊，采用光學(xué)顯微鏡(10×10倍)觀察統(tǒng)計(jì)各處理的孢子囊個(gè)數(shù)(每重復(fù)觀察8個(gè)視野下的孢子囊個(gè)數(shù))。

1.2.4 氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素對(duì)白及疫病的盆栽防治效果 選擇對(duì)白及疫病病原菌毒力較強(qiáng)的2種殺菌劑10%氟噻唑吡乙酮OD和1%申嗪霉素SC，測(cè)定其對(duì)白及疫病的盆栽防治效果。分別配制氟噻唑吡乙酮有效濃度為40 μL/L和60 μL/L，申嗪霉素有效濃度為17 μL/L和25 μL/L，以68%精甲霜·錳鋅有效濃度2.4 g/L作為對(duì)照藥劑。以噴施等量清水為空白對(duì)照。在白及長(zhǎng)至4～6葉片時(shí)，每片葉接種1塊白及疫病病原菌菌餅，3次重復(fù)，每重復(fù)接種10～15片葉，以接種無菌V8培養(yǎng)基為空白對(duì)照。藥劑的施藥方法設(shè)先施藥后接種和先接種后施藥2種方式。第1次施藥分別在接種病原菌前24 h和接種后24 h進(jìn)行；第2次施藥均在接種6 d后進(jìn)行。使用電動(dòng)噴霧器施藥，以葉面均勻噴施藥劑至剛好有藥液滴下為標(biāo)準(zhǔn)。第1次病情調(diào)查在接種后6 d進(jìn)行，第2次調(diào)查在第2次施藥后5 d進(jìn)行，共調(diào)查2次。每小區(qū)調(diào)查10片葉，分別記載病葉數(shù)及其病級(jí)，計(jì)算每個(gè)處理的病情指數(shù)及防治效果[4，10]。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4，10]：0級(jí)：葉片無病斑；1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積6%～11%；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=[∑(各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查病葉數(shù)×最高級(jí)數(shù)值]×100

防治效果=[(對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù))/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)]×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS 7.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑的抑菌效果

從表1看出，17種殺菌劑對(duì)白及疫病病原菌的抑菌效果存在明顯差異。隨藥劑有效濃度增加，各藥劑的防效亦升高，濃度為10 μg/mL時(shí)，申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮對(duì)白及疫病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好，抑菌率達(dá)100%，顯著高于其他處理；其次是烯酰嗎啉·嘧菌酯、氟菌·霜霉威和噁霜·錳鋅，抑菌率分別為79.33%、73.46%和65.76%，與其他處理的抑菌率差異顯著；其余殺菌劑抑菌效果低或無抑菌效果。選擇申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，同時(shí)以生產(chǎn)上卵菌病害常用的藥劑噁霜·錳鋅和精甲霜·錳鋅作為藥劑對(duì)照。

表1 17種殺菌劑不同濃度處理對(duì)白及疫病病原菌的抑制率

2.2 不同殺菌劑的室內(nèi)毒力

從表2可知，各藥劑濃度對(duì)數(shù)(x)與菌絲生長(zhǎng)抑制機(jī)率值(y)間均存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。其中，氟噻唑吡乙酮的抑菌效果最強(qiáng)，EC50為0.014 2 μg/mL，申嗪霉素、噁霜·錳鋅抑菌效果其次，EC50分別為1.286 4 μg/mL和11.156 7 μg/mL，精甲霜·錳鋅的抑菌效果最差，EC50為2 210.604 6 μg/mL。在10×10倍視野下，氟噻唑吡乙酮、申嗪霉素、噁霜·錳鋅、精甲霜·錳鋅和清水對(duì)照處理的平均孢子囊個(gè)數(shù)分別為2.04個(gè)、5.83個(gè)、65.29個(gè)、65.88個(gè)和66.29個(gè)。表明，氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素對(duì)孢子囊的產(chǎn)生有較強(qiáng)的抑制作用，其中，氟噻唑吡乙酮的抑制效果最明顯，顯著高于其他藥劑；申嗪霉素其次，與其他處理差異顯著；噁霜·錳鋅和精甲霜·錳鋅對(duì)孢子囊的產(chǎn)生無抑制作用或影響較小。

表2 4種殺菌劑對(duì)白及疫病病原菌的室內(nèi)毒力

2.3 氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素對(duì)白及疫病的盆栽防治效果

從表3看出，各殺菌劑處理對(duì)白及疫病的防效隨著施藥次數(shù)的增加均有一定的提升。預(yù)防試驗(yàn)(接種白及疫病病原菌前24 h施藥)第2次施藥后5 d，10%氟噻唑吡乙酮對(duì)白及疫病的防效最好，有效濃度為40 μL/L和60 μL/L的防效分別為95.11%和95.33%，2組處理間防效差異不顯著，但均顯著高于其余處理；1%申嗪霉素有效濃度17 μL/L和25 μL/L的防效分別為60.16%和71.49%；對(duì)照藥劑68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑有效濃度2.4 g/L的防效最低，為36.94%；治療試驗(yàn)(接種白及疫病病原菌后24 h施藥)第2次藥后5 d，10%氟噻唑吡乙酮有效濃度60 μL/L對(duì)白及疫病的防效最好，其防效為72.36%，顯著高于其余處理；10%氟噻唑吡乙酮有效濃度40 μL/L和1%申嗪霉素有效濃度25 μL/L處理間防效未達(dá)差異顯著水平，但顯著高于1%申嗪霉素有效濃度25 μL/L和對(duì)照藥劑68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑有效濃度2.4 g/L的防效；對(duì)照藥劑68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑有效濃度2.4 g/L的防效最低，為38.13%。氟噻唑吡乙酮在白及疫病病原菌入侵前施藥效果更明顯。

表3 接種白及疫病病原菌前后24 h施殺菌劑對(duì)盆栽白及疫病的防治效果

3 結(jié)論與討論

精甲霜·錳鋅和噁霜·錳鋅是一類保護(hù)性和內(nèi)吸性的混合殺菌劑，能有效緩解病菌產(chǎn)生抗藥性，對(duì)煙草疫霉菌具有較好的室內(nèi)抑菌活性和田間防效[6]。研究結(jié)果表明，噁霜·錳鋅和精甲霜·錳鋅對(duì)白及疫病病原菌的抑菌效果不理想，Ec50分別為11.156 7 μg/mL和2 210.604 6 μg/mL，精甲霜·錳鋅對(duì)白及疫病的盆栽防效也僅為36%左右，可能是因?yàn)椴煌≡曛g對(duì)藥劑敏感性差異、藥劑在不同植物中的滲透和傳導(dǎo)性能不同所致[11]。

研究表明，申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮對(duì)白及疫病病原菌均具有較好的離體和活體抑制作用，尤其是氟噻唑吡乙酮的作用更強(qiáng)，EC50為0.014 2 μg/mL，防效達(dá)95.33%。申嗪霉素是一種抗生素，其作用機(jī)理為通過抑制真菌活性氧的積累進(jìn)一步抑制線粒體中呼吸傳遞鏈的氧化磷酸化作用，從而抑制菌絲生長(zhǎng)，目前廣泛應(yīng)用于防治真菌性根腐和莖腐病[12]，也可防治由疫霉引起的辣椒疫霉型根腐病、煙草黑脛病和馬鈴薯晚疫病等病害，田間防治效果優(yōu)于精甲霜·錳鋅和惡霜靈等傳統(tǒng)內(nèi)吸性殺菌劑[13-15]。申嗪霉素在白及疫病病原菌入侵前后施用的防效在69%左右，均比精甲霜·錳鋅高。

新型殺菌劑氟噻唑吡乙酮為卵菌氧化固醇結(jié)合蛋白抑制劑[16]，對(duì)卵菌病原體引起的植物病害具有特殊活性[17]。目前國(guó)內(nèi)已用于馬鈴薯晚疫病、黃瓜霜霉病及葡萄霜霉病等卵菌病害的田間防治[18-20]，但尚未有用于防治煙草疫霉菌引起病害的報(bào)道。BITTNER等[21]首次在美國(guó)測(cè)試了氟噻唑吡乙酮對(duì)煙草黑脛病菌(P.nicotianae)的毒力，其對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子囊形成的Ec50分別為0.003 9～0.004 9 μg/mL和0.000 52～0.000 81 μg/mL，氟噻唑吡乙酮在田間防治煙草黑脛病同樣具備較好的效果。研究表明，氟噻唑吡乙酮對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)和孢子囊產(chǎn)生具有較強(qiáng)的毒力作用，盆栽防治效果較好，在白及疫病病原菌入侵前施藥效果更明顯，有效濃度為40 μL/L時(shí)防效達(dá)95.11%，與前人研究結(jié)果一致。但申嗪霉素和氟噻唑吡乙酮對(duì)白及疫病的田間防治效果還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

該試驗(yàn)明確了氟噻唑吡乙酮和申嗪霉素對(duì)白及疫病病原菌具有較強(qiáng)的室內(nèi)毒力作用，對(duì)盆栽條件下的白及疫病具有較好的防治效果，且氟噻唑吡乙酮在白及疫病病原菌入侵前施用效果更好，研究結(jié)果可為田間白及疫病的防治藥劑提供參考依據(jù)。