人巨細胞病毒IE1蛋白、WD重復蛋白5在高級別膠質瘤中的表達及意義

邱勇　周軍格　陳俊瑜

【摘要】目的 探討人巨細胞病毒IE1蛋白（HCMV-IE1）及WD重復蛋白5（WDR5）在高級別膠質瘤中的表達及意義。方法 采用免疫組織化學（免疫組化）方法檢測HCMV-IE1和WDR5在60份高級別膠質瘤組織及20份正常腦組織中的表達，分析HCMV感染與WDR5的相關性及兩者對膠質瘤預后的影響。結果 53 份（88.3%）高級別膠質瘤組織中的HCMV-IE1呈陽性表達，20份正常腦組織中均無HCMV-IE1表達（P < 0.001）;HCMV-IE1表達程度低者總生存率優于表達程度高者（P = 0.037）。49份（81.6%）高級別膠質瘤組織中WDR5表達陽性，11份（5.5%）正常腦組織中WDR5表達陽性（P = 0.009）。在60份高級別膠質瘤組織中，HCMV-IE1與WDR5同時高表達有27例（45.0%），同時低表達有14例（23.3%），HCMV-IE1表達與WDR5表達呈正相關（r = 0.336，P = 0.009）。結論 HCMV-IE1與高級別膠質瘤發生發展相關，是判斷高級別膠質瘤預后的指標，其機制可能與HCMV-IE1和WDR5呈正相關有關聯。

【關鍵詞】人巨細胞病毒;高級別膠質瘤;WD重復蛋白5

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of human cytomegalovirus （HCMV）-IE1 protein and WDR5 protein in high grade glioma （HGG）.? Methods The expression of HCMV IE1 and WD repeat-containing protein （WDR5） proteins was detected by immunohistochemistry in 60 HGG tissues and 20 normal brain tissues. The correlation between HCMV infection and WDR5 protein and their influence on glioma prognoses were analyzed.? Results HCMV-IE1 protein was positively expressed in 53 HGG tissues （88.3%） while not expressed in 20 normal brain tissues （P < 0.001）. The overall survival rate of HGG patients with low expression level of HCMV-IE1 was better than those with high expression level of HCMV-IE1 （P = 0.037）. WDR5 protein expression was positive in 49 （81.6%） HGG tissues and in 11 （5.5%） normal brain tissues （P = 0.009）. Among 60 HGG tissues， 27 cases （45.0%） had simultaneously high expression HCMV-IE1 protein and WDR5 protein， and 14 cases （23.3%） had simultaneously low expression. The expression of HCMV-IE1 protein was positively correlated with that of WDR5 protein （r = 0.336， P = 0.009）. Conclusions HCMV-IE1 protein is associated with the initiation and development of HGG and is an indicator of the prognosis of HGG.The mechanism may be associated with the positive correlation between HCMV-IE1 and WDR5.

【Key words】Human cytomegalovirus;High grade glioma;WD repeat-containing protein

膠質瘤是最常見的原發性神經上皮細胞惡性腫瘤，WHO依據腫瘤的惡性程度將膠質瘤分為Ⅰ ～ Ⅳ級，其中低級別膠質瘤（LGG）包含Ⅰ、Ⅱ級，高級別膠質瘤（HGG）包含Ⅲ、Ⅳ級[1]。近年來隨著神經外科顯微手術技術及手術器械的發展，膠質瘤的手術治療效果取得改善，但膠質瘤患者的預后未能獲得根本的改善，尤其是HGG，腫瘤細胞呈侵襲性生長，術后腫瘤短期內就復發。手術輔以同步放射治療或化學治療的標準化方案是目前腦膠質瘤的主要治療手段，由于HGG本身發生發展的分子機制，其容易對放射治療及化學治療發生抵抗，雖然各種新治療方法不斷涌現，但治療效果仍較差[2]。目前腫瘤的靶向及免疫治療等個體化精準治療成為新的熱點，而我們對于神經膠質瘤的病因學及遺傳表征知之甚少。目前認為膠質瘤是一種“冷腫瘤”，腫瘤突變負荷較低，對傳統放射治療、化學治療以及免疫治療等方法響應有限，因而迫切需要研究膠質瘤可利用的新的靶點和遺傳學表征，為膠質瘤的治療提供新的思路。

最近的研究表明，病毒感染可能與腫瘤的發生發展相關[3]。人巨細胞病毒（HCMV）屬于皰疹病毒家族，人巨細胞病毒基因組編碼有200多種蛋白質，包括HCMV IE1蛋白（HCMV-IE1）和PP65抗原等。它們的表達發生在感染后的一系列階段。有研究表明HCMV感染及病毒蛋白與多種惡性腫瘤相關[4]。同時已陸續有研究報道膠質瘤中存在HCMV抗原的表達甚至完整病毒，而其鄰近正常腦組織中則檢測不到，特別是在膠質母細胞瘤樣本中，膠質瘤中存在蛋白的陽性率高達93% ～ 100%，甚至有報道稱術后抗病毒治療能明顯延長患者生存期，但其具體機制尚未清楚。在我國，健康人群中HCMV的感染率（90%左右）高于歐美國家（60% ～ 70%）。WD重復蛋白5（WDR5）是組蛋白甲基轉移酶復合物中的核心組分之一，參與介導H3K4基因轉錄激活過程，研究顯示WDR5在腫瘤發生發展過程中發揮著重要的作用[5]。

本研究采用免疫組織化學（免疫組化）方法檢測了HCMV-IE1及WDR5在HGG組織中的表達水平，并進一步分析了兩種蛋白的相關性及其對膠質瘤預后的影響。

材料與方法

一、組織標本

60份HGG組織均為武漢腦科醫院2013年至2018年神經外科手術切除的原發腫瘤標本，20份正常腦組織為該院同時期的腦外傷內減壓手術患者標本。60份HGG組織來自男性患者33例、女性患者27例，年齡（48.2±16.2）歲;標本均經福爾馬林固定、石蠟包埋。按照2016年WHO中樞神經系統腫瘤分類和分級標準進行確診，其中WHO Ⅲ級44例，包括間變型星形細胞瘤35例、間變型少突膠質細胞瘤9例;WHO Ⅳ級16例，均為膠質母細胞瘤。所有患者術后均持續隨訪，最長隨訪時間5年。本研究經武漢腦科醫院倫理委員會批準。

二、免疫組化方法

采用聚合物-過氧化物酶免疫組化兩步法。組織蠟塊連續切片，厚5 μm，65℃烤片2 h后備用。二甲苯常規脫蠟，浸入乙二胺四乙酸緩沖液中高熱修復。切片用3% 過氧化氫于室溫下孵育15 min，以封閉內源性過氧化物酶活性。非免疫正常山羊血清100 μl封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育60 min。滴加一抗HCMV-IE1（英國Abcam公司）稀釋度1∶100及WDR5（上海生工生物公司）稀釋度1∶100。于4℃冰箱孵育過夜，再用Biotin標記的山羊抗鼠二抗工作液室溫孵育30 min。用辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，室溫孵育30 min。用二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。以HCMV-IE1、WDR5表達陽性的結腸癌組織切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

三、建立免疫組化分級和強度量表，

免疫染色切片由2名獨立的組織病理學專家進行評估，所有的免疫組化染色均給予一個等級（基于陽性百分比）。在高倍鏡下從每例標本中腫瘤細胞免疫反應較強的區域隨機選取5個視野，共計數1000個細胞，根據陽性細胞的估計百分比確定4個等級：（-）<5%;（+）≥5% ～ 30%;（++）≥30% ～ 50%;（+++）≥50%。依據陽性表達的等級，我們將腦腫瘤標本分為2組，低表達組（-或+）和高表達組（++或+++）。

四、統計學處理

采用SPSS 20.0進行統計學分析， HCMV-IE1及WDR5表達水平在HGG與正常腦組織之間的差異采用Wilcoxon秩和檢驗。進行HCMV-IE1蛋白與WDR5表達相關性關聯分析。采用GraphPad Prism 7.0軟件進行生存分析，生存曲線的繪制采用Kaplan-Meier法，生存曲線比較采用log-rank檢驗。P < 0.05 為差異有統計學意義。

結果

一、HCMV-IE1、WDR5在膠質瘤中的表達

在60份HGG組織中有53份HCMV-IE1呈陽性表達，陽性表達率88.3%。其中16份（+）、18份（++）、19份（+++），HCMV-IE1位于腫瘤細胞的胞核和胞漿。在60份膠質瘤組織中，高表達組有37份（61.7%）、低表達組有23份（38.3%）。HCMV-IE1在20份正常腦組織中均無表達。HGG組織中HCMV-IE1表達水平高于正常腦組織（Z = -6.110，P < 0.001），見圖1。

在60份HGG組織中有49份WDR5呈陽性表達，陽性表達率為81.6%。其中13份（+）、19份（++）、17份（+++）。WDR5位于腫瘤細胞的胞核。在60份膠質瘤組織中，高表達組有36份（60.0%）、低表達組有24份（40.0%）。在20份腦組織中11份WDR5呈陽性表達，陽性表達率55%，其中高表達組6份（30.0%）、低表達組14份（70.0%），HGG組織中WDR5表達水平高于正常腦組織（Z = -2.569，P = 0.009），見圖1。

二、HCMV-IE1與WDR5的相關性

在60份HGG中，HCMV-IE1與WDR5同時高表達有27份（45.0%），同時低表達有14份（23.3%），HCMV-IE1表達與WDR5表達相關（r = 0.318，P = 0.009）。

三、HCMV-IE1表達與HGG預后的關系

HCMV-IE1低表達組23例的中位生存期為33個月，高表達組37例的中位生存期為18個月，低表達組患者總生存率優于高表達組（P = 0.037），見圖2。

討論

HCMV是人類皰疹病毒，其基因組大小約235 kb。病毒基因表達呈時序性，分為立即早期、早期和晚期。對于免疫力正常的健康人群，HCMV感染常無明顯臨床癥狀，但在有免疫缺陷或免疫力低下的人群，HCMV感染常導致嚴重臨床后果，表現為病毒性肺炎、先天性腦畸形、腦炎等。依據不同國家和人種，HCMV在健康人群中的感染率可達70 % ～ 100 %，本課題組調查了本地區的303名健康人HCMV的感染情況，結果顯示感染陽性率為93.7%，進一步證實HCMV感染在我國健康人群中高發[6]。

目前的研究顯示，病毒感染可以通過干預腫瘤微環境來影響腫瘤的進展，從而影響腫瘤細胞的生物學行為。現在研究表明HCMV與多種惡性腫瘤相關，如消化系統腫瘤、肺惡性腫瘤及乳腺癌等。HCMV-IE1通過激活環氧酶-2（Cox-2）誘導炎癥介質的合成，激活血管內皮生長因子（VEGF）的表達，促進腫瘤血管生成和腫瘤發生發展[7]。但HCMV與膠質瘤的具體關系及機制不明，存在巨大爭議。有學者認為HCMV與膠質瘤的發生有關，是一個起始因素，但與膠質瘤的病理級別及預后無關[8-9]。而其他學者的觀點與之截然相反，認為HCMV-IE1在膠質瘤組織中的表達水平明顯高于對照腦組織，其表達程度與膠質瘤病理級別有相關性[10]。同時HCMV與膠質瘤的預后明顯相關[11]。但有學者提出異議，認為上述實驗研究未能將患者腫瘤病理級別對膠質瘤預后的影響因素進行剔除。本課題組發現HCMV感染與HGG預后的國內相關研究甚少，故進行了本項研究。

WDR5是WD-40蛋白家族的成員之一，具有高度的保守性。WDR5作為MLL復合體的重要成員，能引起組蛋白H3K4的甲基化，從而參與多項細胞的生命活動，包括調節細胞自我編程以及更新，誘導細胞分化、信號轉導、mRNA處理、基因調控、囊泡轉運和細胞周期的調節[12]。最近的研究表明，WDR5在多種癌癥的發生發展過程中起著重要作用，Xu等[13]在甲狀腺腫瘤中發現WDR5的過表達促進了腫瘤細胞的增殖和遷移，并且與患者生存率密切相關。Chen等[14]的研究表明，WDR5蛋白在膀胱癌中也呈高表達狀態，可以促進腫瘤細胞增殖及對化學治療的耐藥性，進一步研究表明WDR5是通過對細胞周期蛋白的調節進而激活其轉錄從而實現其功能的。WDR5在膠質瘤組織中的作用尚無報道。

本課題組收集60份HGG標本并對患者持續隨訪，結果顯示HCMV感染僅在膠質瘤中存在，不存在于正常腦組織中，提示HCMV感染與HG的發生發展存在一定聯系。同時HCMV-IE1低表達組患者總生存率高于高表達組患者，本組患者均為HGG患者，剔除了病理級別因素對膠質瘤預后的影響，這項結果提示HCMV-IE1與膠質瘤惡性進展相關，可以作為判斷HGG預后的指標。本研究還顯示，HGG組織中WDR5表達高于正常腦組織，我們認為WDR5與膠質瘤的發生發展也密切相關。目前有研究表明HCMV感染時，其通過HCMV-IE1上調WDR5的表達，進而導致細胞增殖分化，同時WDR5促進病毒的復制[15]。本研究顯示HCMV-IE1表達與WDR5表達呈正相關，結合前述研究，我們認為HCMV可能通過調節WDR5，最終激活膠質瘤相關靶基因MMP-9、c-myc、 Cox-2等的轉錄， 從而參與腫瘤發生發展，同時影響膠質瘤對化學治療藥物的敏感性[5， 14， 16]。

膠質瘤患者經標準規范治療后預后仍極差，特別是HGG。因而針對HGG的靶向治療和免疫治療等個體化精準治療已成為研究的熱點。但即使應用新的靶向治療及腫瘤電場治療等方法，治療效果仍然差強人意，患者預后極差。所以利用HCMV抗原作為膠質瘤治療的新靶點可為HGG患者帶來新的希望。臨床實驗研究顯示，常規綜合治療輔助抗病毒藥物可能是一種新的治療膠質瘤方案[17]。HCMV抗原也可以作為免疫治療的有效靶點[18]。多項針對HCMV抗原設計的免疫治療臨床試驗例如自體巨細胞病毒特異性T淋巴細胞，靶向HCMV的CARs和多肽類疫苗等，均明顯改善患者的無進展生存期及總生存期[19]。另外，針對WDR5的藥物可通過阻斷MLL-WDR5蛋白復合體的形成，干擾癌基因的轉錄，從而抑制腫瘤的生長[20]。

綜上所述，HCMV感染及其蛋白HCMV-IE1通過調節WDR5的表達，影響膠質瘤的惡性進展，這不是一種伴隨的偶然現象，HCMV-IE1可以作為判斷HGG預后的生物學標志物，同時也為HGG患者的治療提供新的靶點。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-03-26）

（本文編輯：洪悅民）