基于高通量測序的濃香型窖泥原核微生物群落的窖池空間分布

胡曉龍，王康麗，余 苗，牛廣杰，孟書劍，馬安銀，李 紅，樊建輝，何培新

（1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.河南仰韶酒業有限公司博士后創新實踐基地，河南 澠池 472400；3.河南壽酒集團有限公司，河南 輝縣 453600；4.五糧液集團有限公司，四川 宜賓 644000）

窖泥主要用于濃香型白酒生產，其中棲息著大量兼性及專性厭氧微生物，如乳酸菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、產己酸菌屬（Caproiciproducens）、梭菌屬（Clsotridium）、Petrimonas、嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）和甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）等原核微生物及酵母（Saccharomyces和Pichia）和霉菌（Rhizopus和Aspergillus等）等真核微生物[1-4]。其中窖泥細菌數量遠多于真菌[5]，且窖泥中原核微生物群落α-及β-多樣性與窖泥窖齡及質量均有明顯的關聯性，如新窖和退化窖泥中厚壁菌門含量明顯高于老窖和優質窖泥，擬桿菌門和廣古菌門則相反[6-7]。

微生物群落解析技術如磷酸脂肪酸（phospholipid fatty acids，PLFAs）技術、核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）基因克隆文庫技術、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）及高通量測序等的不斷涌現和更新[8]，尤其是高通量測序技術在窖泥微生物研究中的廣泛應用，極大地豐富了對窖泥微生物多樣性的認識，如HU X L等[7]從江蘇某酒企窖泥中檢測到33個原核微生物門及225個屬，明晰了窖泥中的優勢微生物如厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）及廣古菌門（Euryarchaeota）等及稀有微生物Saccharibacteria和泉古菌門（Crenarchaeota）等[3，6-7，9]。目前高通量測序技術在窖泥研究中的應用主要包括不同窖齡、質量、性狀、地理位置及窖池空間位置窖泥菌群的研究，且主要為四川產區的窖泥樣品[3，6，9-13]。但是，對我國北方（河南和山東等）濃香型白酒主產區窖泥微生物群落的演替性及空間異質性研究較少。此外，鄭佳等[14]研究發現，窖泥香氣成分的含量與其在窖池空間位置（共9個位置）存在一定的相關性，且每個位置窖泥能較好地聚類。但目前對窖泥原核微生物群落多樣性在窖池空間分布特征的系統研究鮮有報道，之前大多數研究僅選取窖壁泥[11]或窖底泥[6]分別單獨研究，或者將窖壁上層或中層窖泥與窖底進行比較研究[3，15-16]。因此，本研究以河南某濃香型白酒酒企6年和12年窖齡窖池中上層、中層、下層及窖底窖泥為研究對象，分析供試窖池中窖泥微生物群落多樣性及組成，及其演替性、空間分布特征和影響因素，以期為進一步認識我國北方窖泥微生物菌群組成及其隨窖齡及空間的變化特征提供基礎數據，以及為探究不同位置窖泥微生物菌群結構對窖泥老熟、白酒風味形成等的具體貢獻提供一定的科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣品：河南某濃香型白酒企業提供；重鉻酸鉀、酒石酸銻鉀、亞硝基鐵氰化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、高氯酸鈉、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、鹽酸、硼酸、氯化銨、鉬酸銨、氟化銨（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；Magen HiPure Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：廣州美基生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PB-10 PH計：德國Sartorius公司；UV BlueStar A紫外分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；DF-1集熱式恒溫磁力攪拌鍋：常明市金壇區中大儀器廠；MP200A精密電子天平：上海良豐儀器儀表有限公司；101-1電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業儀器有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥樣品采集

針對該企業6年和12年窖齡窖池進行取樣，每個窖齡隨機選取1口連續使用的窖池。每口窖池窖壁上（PT）、中（PM）、下層（PU）窖泥樣品的采集參照ZHENG J等[17]方法，不同之處是上、下層窖泥取樣位置分別距窖口和窖底平面垂直距離為0.3 m，且每層的兩個樣品混勻后作為該層的代表樣。窖底泥（PB）代表樣品為窖底平面對角線交界點處窖泥和任一條對角線的一個四分位點處窖泥的混合物。因此，每口窖池共取4個代表樣品，共計8個窖泥樣品并做好標記，其中PT6/12、PM6/12、PU6/12和PB6/12分別代表6/12年窖池的上、中、下層及窖底樣品。將每個窖泥代表樣品均分為2份于-20 ℃冰箱保存，分別用于窖泥理化性質分析和窖泥微生物高通量分析。

1.3.2 理化指標測定

參照李俊輝等[18]的烘干法和電位法分別測定窖泥含水量及pH；采用酸堿中和滴定法測定總酸含量[19]；參照農業行業標準NY/T 1121.7—2014《土壤檢測第7部分：土壤有效磷的測定》測定窖泥中有效磷含量；采用靛酚藍比色法測定窖泥中銨態氮含量[20]。

1.3.3 窖泥宏基因組提取及Illumina Miseq測序

利用Magen HiPure Soil DNA Kit試劑盒并參照說明書對窖泥樣品總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行提取，然后用Qubit 2.0熒光定量儀測定其濃度和純度。將合格的DNA委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成建庫及Illumina MiSeq雙端測序。其中16S rDNA擴增子引物對為F：5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3'和R：5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'，擴增區域為16SrDNA的V3-V4區。

1.3.4 數據分析

采用Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（v1.9.6）及QIIME（v1.9.1）軟件對高通量測序序列進行質控。使用VSEARCH（v1.9.6）將有效序列進行聚類，其中相似性＞97%的序列歸為1個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。利用核糖體數據庫程序（ribosomal database program，RDP）貝葉斯算法對OTU 的代表性序列進行物種分類學注釋。采用金唯智云平臺完成基于樣品OTUs信息（進化及豐度）的加權（weighted）UniFrac distance 聚類分析。采用軟件Canoco 5繪制冗余分析（redundancy analysis，RDA）圖譜；采用Heml軟件繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 窖泥樣品理化指標及微生物群落α-多樣性

由表1可知，隨窖池深度增加，窖壁泥含水量呈增加趨勢，窖底泥處于窖壁上層和下層窖泥之間；窖池下部（PU和PB，下同）窖泥中pH、銨態氮和有效磷含量均高于窖池上部（PT和PM，下同），其中窖底泥的銨態氮和有效磷含量高于窖壁；總酸變化趨勢與之相反。隨著窖齡增加，窖泥理化性質也出現不同程度的變化，如相同位置窖泥（窖底泥除外）的銨態氮及有效磷呈下降趨勢，總酸含量上升（中層窖泥除外）等。整體上，窖池上部和下部窖泥之間的理化性質差異明顯，而上部之間、下部之間以及同一位置不同窖齡之間窖泥理化性質差異相對較小，如不同窖齡上部窖泥PT6、PM6、PT12和PM12的pH分別為3.46、3.56、3.53和3.67，而下部窖泥PU6、PB6、PU12和PB12的pH分別為5.95、5.50、4.81和5.67。

由表1可知，供試窖泥樣品中OTU數量在185～392個之間，Chao1指數在212.79～443.07之間，Shannon指數在1.00～3.87之間。從窖池位置分析，隨窖池深度增加，Shannon指數結果顯示不同窖齡窖泥物種多樣性均呈先升后降趨勢，下層最高，且下部窖泥明顯高于上部窖泥。OTU數量、Chao1和ACE指數表明窖泥微生物物種豐度也均呈先升后降趨勢，中層物種豐度最高，這與WANG C D等[11，21]的研究結果一致。隨著窖齡增加，同一位置窖泥的物種多樣性差異不大；但物種豐度存在一定的差異，尤其是6年窖池中層窖泥物種豐度明顯高于12年窖池中層窖泥。

2.2 窖泥微生物群落β-多樣性

2.2.1 基于UniFrac分析的窖泥樣品聚類

圖1 基于6年和12年窖池不同位置窖泥菌群的weighted UniFrac distance聚類分析Fig.1 Weighted UniFrac distance cluster analysis based on microbial community in pit mud at different positions of 6-year and 12-year cellars

Weighted UniFrac（同時考慮物種有無及其豐度信息）聚類分析結果見圖1。由圖1可知，供試窖泥樣品分為2組，分別為窖池上部和下部窖泥，這主要是由于窖池上部窖泥之間理化性質相似，下部窖泥之間相似，但兩者差異較大（見表1）。此外，每個組又可以分為2個亞組，將窖池4個位置的窖泥完全區分開來。不同年份的窖泥分布于不同亞組，表明在供試窖池中，較之于窖齡，不同位置環境理化指標是造成窖泥微生物群落差異的主要因素。張會敏等[3]的研究結果（Weighted UniFrac分析）也與該結論相似，如老窖池（＞50年）的窖底泥與新窖池（5年）的窖底泥能更好地聚在一起，而與部分老窖池（＞50年）的窖壁泥分屬不同的分類組。

2.2.2 窖泥原核微生物門/屬水平組成

窖泥原核微生物門水平組成檢測結果見圖2。由圖2可知，在門水平，共檢測到12個細菌門和1個古菌門（廣古菌門（Euryarchaeota））。其中5個優勢菌門（所有樣品中平均含量＞1%的門，圖2中下滑實線標注）及4個次優勢菌門（至少在一個樣品中含量＞1%的門，圖2中下滑虛線標注）占每個樣品總含量的99%以上。優勢菌厚壁菌門（Firmicutes）（72.3%）＞擬桿菌門（Bacteroidetes）（13.0%）＞廣古菌門（Euryarchaeota）（6.0%）＞變形菌門（Proteobacteria）（4.8%）＞Cloacimonetes（1.6%）。從窖池空間位置分析，兩類窖齡窖泥門水平微生物群落組成的空間變化規律基本一致，如厚壁菌門（Firmicutes）（41.2%～97.7%）隨窖池深度增加均呈先下降再上升的趨勢，下層窖泥含量（PU6 41.2%、PU12 52.8%）最低；而擬桿菌門（Bacteroidetes）（0.6%～39.9%）變化規律與之相反，下層窖泥含量最高。此外，變形菌門（Proteobacteria）在窖池上部的含量（平均值9.46%）遠大于窖池下部窖泥（0.05%），且中層窖泥含量最高（16.6%）；窖池下部窖泥中廣古菌門（Euryarchaeota）含量（11.7%）明顯高于窖池上部窖泥（0.31%）。從窖齡看，相同位置窖泥之間一些菌門的含量也發生了變化，隨著窖齡增加，窖池上層和中層的變形菌門（Proteobacteria）及下層的廣古菌門（Euryarchaeota）含量明顯增加，窖壁下層的Cloacimonetes和軟壁菌門（Tenericutes）及窖底的廣古菌門（Euryarchaeota）含量則明顯下降等。

圖2 窖泥原核微生物門水平組成Fig.2 Composition of prokaryotic microorganisms in pit mud at phyla level

在屬水平，所有樣品中共檢測到165個屬，其中下層窖泥PU6和PU12注釋度最低，分別僅有81.1%和77.2%序列被注釋，其余樣品注釋度均高于93%。本研究選取每個樣品含量前10的屬（Top10，共33個）進行熱圖分析從更小分類等級水平揭示供試窖泥的微生物群落組成差異，結果見圖3。由圖3可知，其占每個樣品的65.6%～98.7%，涵蓋了所有優勢屬（＞1%，共14個，圖3中下劃線標注），分屬于芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）等7個綱；且窖池上部和下部窖泥分別聚為i和ii兩簇，與圖1結果吻合。

從窖泥位置分析，Top10屬可分為兩類，其中①類相關屬是指其在上部窖泥的平均含量＞下部的屬，共14個屬，含3個優勢屬；②類相關屬變化情況與①類屬相反，共19個屬，含11個優勢屬。隨窖池深度增加，57.6%（19/33）的屬變化規律完全一致（見圖3），占所有樣品含量的69.5%，表明其窖池空間分布可能與窖齡無關。

不同窖齡窖泥優勢屬含量的空間分布特征見圖4。由圖4可知，以優勢屬為例，64.3%（9/14）的優勢屬含量在6年和12年窖齡窖池中的空間分布特征完全一致。如乳桿菌屬（Lactobacillus）含量隨著窖池深度增加而下降，且下部窖泥（1.5%）遠低于上部窖泥（78.6%）；產己酸菌屬（Caproiciproducens）和嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）與之相反等。甲烷囊菌屬（Methanoculleus）等5個屬在兩類窖齡窖池中分布存在異同，差異主要為其在6年窖池上部隨深度增加而增加，在12年窖池上部持平或降低；相同之處是其（Petrimonas除外）在窖池下部隨深度均增加。整體上，窖泥微生物的空間分布差異主要體現為上部和下部窖泥之間，其中78.6%（11/14）的優勢屬在兩類窖池下部窖泥含量高且集中在梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）和擬桿菌綱（Bacteroidia）。

圖3 基于每個樣品中含量前10屬的熱圖分析Fig.3 Heatmap analysis based on genera with Top 10 content in each sample

圖4 不同窖齡窖泥優勢屬含量的空間分布特征Fig.4 Spatial distribution characteristics of dominant genera content in pit mud of different-aged cellars

查閱相關文獻發現多數新窖泥、窖壁上層泥及退化窖泥中主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）[3，6-7，12]，與供試窖池上部窖泥相似；而隸屬于梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、甲烷微菌綱（Methanomicrobia）及甲烷桿菌綱（Methanobacteria）中的部分屬主要分布在老窖泥、窖底泥、正常及優質窖泥中[6-7，9，11]，與供試窖池下部窖泥相似。此外，梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）中的屬及甲烷菌是維持窖泥菌群網絡結構穩定、微生態平衡及代謝白酒中重要呈香物質及其前體物質（如己酸、丁酸等）的主要微生物[6-7]，如產己酸菌屬（Caproiciproducens）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、梭菌屬（Clostridium）、Petrimonas和甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）等；而高含量的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是導致窖泥微生態失衡，乳酸積累、pH下降及窖泥退化的主要因素[6-7]。上述結果有助于從微生物群落層面解釋生產實踐中窖池上部窖泥易于退化而窖底泥易老熟的現象。

從窖齡分析，隨窖齡增加，Top10屬（占每個樣品微生物含量的65.6%～98.7%）共存在132個（33個屬×4個位置）變化（增加、減少和不變情形的數量），但75.6%的變化均＜1%，表明兩類窖齡的供試窖池中Top10屬含量變化不大。這可能是由于窖泥自然老熟是一個緩慢（25年左右）的過程[6]，而本研究所取窖泥的窖齡僅為6和12年，正處在窖泥老熟過程中。此外，僅有12.1%（4/33）的屬在所有層次窖泥中隨時間的變化趨勢完全一致，表明窖泥Top10屬變化趨勢與其位置相關性更高（見圖3）。各層窖泥優勢屬隨窖齡變化趨勢見圖5。

圖5 各層窖泥優勢屬隨窖齡變化趨勢Fig.5 Change trends of dominant genera in different layers of pit mud with pit age

由圖5可知，隨窖齡增加各位置窖泥中變化趨勢完全一致的屬僅有嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）、沉積菌屬（Sedimentibacter）、Cloacimonadaceae_LNR_A2-18 和 不 動桿菌屬（Acinetobacter），其中前3個屬含量均下降而后者均增加，其余屬在各位置窖泥中的變化趨勢存在差異，如Caproiciproducens含量隨窖齡增加，其在中層窖泥中含量下降，在下層和窖底窖泥中均增加。將屬含量增加或減少超過3%的情形定義為明顯變化，共有8個屬在相應位置發生了明顯變化。其中下層窖泥中發生明顯變化的屬數量最多（5個），這主要是由于6年和12年窖池下層窖泥的理化性質變化明顯大于其他位置窖泥（見表1），尤其是顯著影響窖泥微生物群落組成的pH、銨態氮和有效磷均發生了較大的變化[6-7，13]。

2.3 窖泥理化因子與微生物群落的冗余分析

如前所述，空間位置及窖齡在一定程度上均影響供試窖泥的原核微生物群落α-及β-多樣性（見圖1和圖5），這主要是由于不同窖齡和位置窖泥的理化性質存在差異，其是影響微生物群落多樣性改變的本質因素[22]。窖泥理化性質與Top10屬之間的相關性冗余分析（RDA）結果見圖6，其中該圖中僅顯示了每個Top10屬名稱的縮寫（前8個字母），結合圖3可知其全稱。由圖6可知，樣品的分布和聚類情況表明供試窖泥原核微生物群落的分布具有明顯的窖池空間異質性，且受窖齡影響較小。兩個主成分對兩者相關性的總解釋度83.7%，其中與pH、銨態氮和總酸相關性高（其與坐標軸夾角小）[3]的軸1對兩者相關性的解釋度最高（64.3%），表明其對窖泥菌群分布影響較大，尤其是區分窖池上、下部窖泥樣品；軸2主要用于區分下層和窖底泥微生物群落組成，解釋度19.4%，與含水量和有效磷相關性最高。諸多研究表明，pH、銨態氮、有效磷和含水量均能顯著影響窖泥微生物群落結構（P＜0.05），進而影響窖泥老熟及質量提升等[3，7]。條件限制效應（conditional term effects）綜合分析了各理化因子對菌群結構影響的貢獻度及顯著性，其中銨態氮（60.4%）和有效磷（17.7%）對菌群影響較大且呈極顯著相關（P＜0.01），然后依次為含水量、pH和總酸但均不顯著。這主要由于銨態氮和有效磷為環境中微生物生長繁殖提供快速利用的氮和磷營養物質，進而顯著影響窖泥微生物群落β-多樣性[6-7，13]。這也表明銨態氮和有效磷對供試窖泥微生物群落組成的空間異質性和演替程度影響可能要高于pH及含水量等。此外，Top10屬與窖泥理化性質存在明顯的交互作用，如乳桿菌屬（Lactobacillus）與總酸含量呈強烈的正相關，與pH呈明顯負相關，這主要是由于乳酸為其主要代謝物，乳酸的積累會導致總酸含量增加而pH下降；嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）和Petrimonas與pH呈明顯的正相關，這主要是由于這兩個屬的部分細菌最適pH為堿性（7.1～8.0）[23]。

圖6 基于窖泥Top10屬微生物與其理化指標的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis based on top 10 genera microorganisms in pit mud and physicochemical indexes

3 結論

本實驗對河南某濃香型白酒企業6年和12年窖池中窖泥微生物群落組成、以及其演替性及空間分布特征進行研究。在供試窖泥樣品范圍內，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、變形菌門（Proteobacteria）和Cloacimonetes為其優勢菌門；乳桿菌屬（Lactobacillus）、產己酸菌屬（Caproiciproducens）、嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）及甲烷囊菌屬（Methanoculleus）等14個屬為其優勢屬。門和屬水平微生物群落β多樣性分析結果均表明，位置對窖泥微生物群落組成的影響要強于窖齡，且57.6%（19/33）Top10屬的空間分布規律與窖齡無關。窖泥微生物的空間分布差異主要體現為上部（上層和中層）和下部（下層和窖底）窖泥之間，如Lactobacillus在窖池下部窖泥含量遠低于上部窖泥；78.6%的優勢屬在窖池下部含量高且集中在梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）。窖泥微生物群落組成隨窖齡變化較小，例如隨窖齡增加，Top10屬產生了132個變化，其中75.6%的變化均＜1%。RDA分析顯示窖泥微生物群落β-多樣性與窖泥銨態氮和有效磷含量極顯著相關（P＜0.01），表明其可能是影響供試窖泥原核微生物菌群空間分布的主要環境因子。

本研究在一定程度上豐富了人們對河南白酒產區窖泥微生物群落的認識，證實了窖泥微生物群落具有明顯的窖池空間異質性，對進一步探究不同位置窖泥微生物菌群對窖泥老熟、白酒風味形成等具體貢獻可能具有一定的積極作用。由于本實驗窖泥樣品數量受限，因此在后續研究中增加所選窖池窖齡跨度及平行窖池的數量，從而進一步檢驗和完善本研究的結果是極為必要的。