HPLC法快速檢測黑糯米酒中有機酸含量

王洪琳，蘇 偉，母應春，姜 麗，趙 馳

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

酸是酒中重要的呈味物質，有機酸在酒的口感和風味中起著關鍵作用[1]，其含量直接影響黑糯米酒的口感[2]，含量過低，導致酒體平淡無味，過高則使酒體生硬粗澀，是酒中酸味的主要承擔者，與其他呈味化合物共同組成酒特有的芳香，具有一定的呈香、呈味作用。此外，有機酸還可以溶解酒中色素，使酒的顏色更加純凈美觀[3]，且適量的有機酸能抑制細菌的生長，降低黑糯米酒的甜度，增強黑糯米酒的濃香，還能在貯藏過程中促進酯類物質形成[4]。由于釀造工藝和釀造原料的不同，使得黑糯米酒中主要有機酸種類和含量有一定的差異。因此，對黑糯米酒中主要有機酸進行測定，明確黑糯米酒中有機酸種類和含量對調整黑糯米酒的口味和提高酒的質量尤為重要[5-6]。

目前有機酸的測定常采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）[7]、酸堿滴定法[8]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[9-11]、紅外光譜（infrared spectrum，IRS）法[12]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13]等。其中HPLC法準確度高、樣品前處理簡單、重現性好，且操作簡單，可同時測定多種有機酸，已得到廣泛應用[14]。但在實際檢測中，由于使用儀器和色譜柱型號的差異，測定方法和色譜條件也有所相同。本試驗在前人研究的基礎上，對黑糯米酒中有機酸含量的測定方法進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11種黑糯米酒（依次編號為HMJ1～HMJ11，HMJ1福建龍巖；HMJ2、HMJ3廣東梅州；HMJ4、HMJ5廣東河源；HMJ6、HMJ7陜西洋縣；HMJ8貴州清鎮；HMJ9、HMJ10、HMJ11貴州惠水）：市售。磷酸二氫鈉、酒石酸（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、乳酸、草酸、檸檬酸、磷酸（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；丙酮酸、L-蘋果酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、琥珀酸（均為分析純）：麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）：河北百靈威超精細材料有限公司。

1.2 儀器與設備

安捷倫1260高效液相色譜儀（配置G1329B自動進樣器、G1311C四元低壓泵、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器，ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品處理：同時將樣品未處理、活性炭處理和離心處理，過0.22 μm濾膜后上機發現測試結果差異不顯著，故不對樣品進行處理，直接取樣過0.22 μm水系濾膜后待上機。

有機酸混標的配制：分別稱取草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、焦谷氨酸、蘋果酸各0.050 g，酒石酸、琥珀酸各0.10 g，乳酸0.42 g，乙酸1.05 g，用蒸餾水溶解后于100 mL容量瓶定容至刻度，制成母液待用。

1.3.2 色譜條件的優化

取有機酸混標母液10 mL定容至50 mL容量瓶，在200～400 nm范圍內對其進行掃描，發現在波長210 nm處各有機酸峰形及吸收峰最佳，故測定波長確定為210 nm。

（1）流動相磷酸鹽的選擇

多數緩沖液在波長210 nm附近有較強的吸收，磷酸鹽緩沖液是最典型、最適合的緩沖液，其在紫外區幾乎無吸收，可以提高檢測的靈敏度，因此選擇磷酸鹽作為有機酸分析的流動相。分別配制0.02 mol/L的磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉及磷酸氫二銨溶液，調節pH值為2.90；進樣量：10 μL；檢測器：G1315D；ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱溫：35 ℃；流速：0.00～4.00 min，流速為1.0 mL/min；4.00～10.00min為0.30mL/min；10.00min后流速為1.0mL/min；檢測波長：210 nm。

（2）流動相濃度的選擇

緩沖液濃度的高低影響溶液的離子強度及有機酸在流動相中的存在形式，從而影響色譜柱對有機酸的分離效果，其濃度越高，待測有機酸的存在形式越穩定。但其濃度又不宜過高，濃度升高會增大離子強度，對組分分離不利，同時還影響柱子和泵的使用壽命，從而降低檢測靈敏度。所以配制磷酸二氫鈉溶液的濃度為0.01 mol/L、0.02 mol/L和0.03 mol/L，調節pH值為2.90，其他條件不變，探討不同濃度磷酸二氫鈉作為流動相對各有機酸保留時間及分離效果的影響。

（3）流動相pH值的選擇

因有機酸屬于弱酸，在溶液中的解離程度受溶液pH控制，提高緩沖液H+濃度，有機酸解離平衡則傾向分子態，從而增加有機酸在色譜柱上的保留，各有機酸因其分配系數不同而被分離。故配制pH值為2.50、2.70、2.90和3.10，濃度為0.03mol/L的磷酸二氫鈉溶液。其他條件不變，分析不同pH的磷酸二氫鈉溶液對各有機酸保留時間及分離效果的影響。

（4）柱溫的選擇

流動相的黏度和傳質效率受色譜柱柱溫影響，柱溫升高，流動相的黏度下降，傳質效率提高，使得待測物質保留時間縮短，但柱溫過高不利于組分的分離且影響色譜柱使用壽命。因此選擇柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，濃度為0.03 mol/L的磷酸二氫鈉溶液為流動相，pH值2.90，其他條件不變，分析不同柱溫對10種有機酸分離效果的影響。

（5）流動相中甲醇的比例

流動相中甲醇的加入不僅能改善色譜峰形，還能縮短分析檢測時間，故選擇流動相甲醇-磷酸二氫鈉的比例為0∶100、1∶99、3∶97、5∶95（V/V），探討流動相中甲醇加入的不同比例對有機酸分離效果的影響。

1.3.3 黑糯米酒中10種有機酸的測定

（1）標準曲線的制作

取有機酸混標母液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于50 mL容量瓶，蒸餾水定容至刻度，過0.22 μm濾膜待用。每個濃度做3個平行，以各種有機酸的濃度為自變量，色譜峰的平均峰面積為因變量，外標法定量。

色譜條件：流動相為0.03 mol/L磷酸二氫鈉溶液，不加甲醇，pH2.90；進樣量10 μL；檢測器為G1315D；ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱溫35 ℃；流速：0～4 min，流速為1.0 mL/min；4～10 min為0.30 mL/min；10 min后流速為1.0 mL/min。檢測波長：210 nm。

（2）黑糯米酒中10種有機酸含量的測定

直接取酒樣過0.22 μm水系膜后，按1.3.3中（1）的色譜條件進行測定。

1.3.4 方法性能評價

（1）重復性實驗

按照1.3.3中（1）的色譜條件，取HMJ1樣品1.5 mL過0.22 μm濾膜后，對有機酸的峰面積進行6次測定，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）精密度實驗

按照1.3.3中（1）的色譜條件，取1.3.2中有機酸母液1.5 mL過0.22 μm濾膜，連續進樣6次，測定10種有機酸的峰面積，計算相對標準偏差。

（3）加標回收率試驗

按照1.3.3中（1）的色譜條件，將HMJ1樣品與1.3.2中有機酸混標按1∶1（V/V）混合后取1.5 mL過0.22 μm過濾膜后上機。同時做樣品對照。對10種有機酸進行加標回收率實驗。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 磷酸鹽的選擇

不同磷酸鹽對10種有機酸標準液保留時間及分離效果的影響如圖1所示。

圖1 流動相磷酸鹽種類對10種有機酸分離效果的影響Fig.1 Effect of phosphate types in mobile phase on the separation of 10 organic acids

由圖1可知，以磷酸二氫鈉作為流動相時，10種有機酸都得到了很好的分離，對有機酸檢測得干擾小。對比圖譜可知，當用磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨作流動相時，各有機酸出峰順序一致，但檸檬酸和乙酸之間的分離效果差，且雜峰對琥珀酸的影響較大。因此，本研究選擇使用磷酸二氫鈉作流動相。

2.1.2 流動相中磷酸鹽濃度的選擇

磷酸鹽濃度的不同，各有機酸的分離度也不同，不同濃度磷酸二氫鈉溶液對10種有機酸分離效果的影響結果如圖2所示。

圖2 流動相磷酸二氫鈉濃度對10種有機酸分離效果的影響Fig.2 Effect of sodium dihydrogen phosphate concentration in mobile phase on the separation of 10 organic acids

由圖2可知，磷酸二氫鈉的濃度對于10種有機酸的峰形及分離效果均具有一定的影響，對比3個不同磷酸二氫鈉濃度的色譜圖可知，當磷酸二氫鈉溶液得濃度升高時，10種有機酸的保留時間有所縮短，且10種有機酸的分離效果和峰形越來越好，當磷酸二氫鈉的濃度為0.03 mol/L時，草酸峰形的后拖尾有所改善。因此，本研究選擇0.03 mol/L的磷酸二氫鈉溶液作為流動相。

2.1.3 流動相pH的選擇

不同pH的磷酸二氫鈉流動相對10種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖3所示。

由圖3可知，不同pH的流動相對10種有機酸的分離效果、出峰時間和峰形均存在較大影響，對比不同pH的色譜圖可知，隨著流動相中H+濃度的降低，10種有機酸的保留時間均有較大的縮短，特別是焦谷氨酸的出峰時間由8.86 min提前至7.49 min；同時，pH對檸檬酸和乙酸的出峰時間影響也較大，當pH為2.50時，檸檬酸出峰時間在乙酸后，當pH為2.70時，檸檬酸與乙酸出峰時間重合，難以分離，當pH為2.90，檸檬酸在乙酸前出峰，兩者的之間分離度較好，當pH繼續升高至3.10時，檸檬酸與乳酸出峰時間接近，分離度差，且色譜峰出現一定程度的拖尾現象。故本研究選擇磷酸二氫鈉溶液的pH為2.90。

圖3 流動相pH值對10種有機酸分離效果的影響Fig.3 Effect of pH value of mobile phase on the separation of10 organic acids

2.1.4 柱溫的選擇

不同柱溫對10種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖4所示。

圖4 柱溫對10種有機酸分離效果的影響Fig.4 Effect of column temperature on the separation of 10 organic acids

由圖4可知，柱溫的改變對10種有機酸分離效果的影響較大，當柱溫為25 ℃和30 ℃時，乙酸與檸檬酸出峰時間重合，難以分開，同時乳酸與α-酮戊二酸的分離度和峰形較差。但隨著溫度的升高，10種有機酸均得到有效分離，當溫度為35 ℃時，10種有機酸的分離度和峰形最佳，且噪音低。當溫度繼續升高至40 ℃時，10種有機酸的分離度不受影響，但峰形出現一定程度的拖尾，其中琥珀酸的拖尾較嚴重，且溫度升高時，色譜柱損傷亦隨之增大。故本試驗選擇的柱溫為35 ℃。

2.1.5 流動相中有機相比例的選擇

調節甲醇和磷酸二氫鈉溶液的體積比分別為0∶100、1∶99、3∶97和5∶95（V∶V），其對10種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖5所示。

有機相的加入不僅可以改善峰形，且對色譜柱有一定程度的保護作用，能降低流動相的極性，縮短分析檢測的時間，由圖5可知，甲醇的加入對10種有機酸分離效果和保留時間的影響較大，隨著甲醇的加入，10種有機酸保留時間隨之提前，其分離度也受影響。當加入3%、5%的甲醇時，蘋果酸與α-酮戊二酸、檸檬酸與乙酸不能達到相應的分離效果，與不添加甲醇相比，峰形和噪音改善不明顯。且達不到相應的分離效果，本實驗的色譜柱可耐受純水相，故使用100%無機相作為流動相不會導致色譜柱填料塌陷，且10種有機酸均能在10 min以內達到基線分離，故本實驗不加甲醇。

圖5 流動相中甲醇比例對10種有機酸分離效果的影響Fig.5 Effect of methanol percentage in mobile phase on the separation of 10 organic acids

2.2 黑糯酒中10種有機酸含量的測定

2.2.1 標準曲線回歸方程

分別以10種有機酸的濃度為自變量（x），峰面積（y）為因變量進行標準曲線回歸方程的計算，結果見表1。

表1 10種有機酸回歸方程Table 1 Regression equations of 10 organic acids

由表1可知，10種有機酸的線性回歸方程的相關系數（R2）均大于0.999 0，由此可知10種有機酸在濃度范圍內具有良好的線性關系，且檢出限在0.014 9～0.219 0 mg/L之間，具有較高的靈敏度，可以滿足黑糯米酒中有機酸測定要求。

2.2.2 黑糯米酒中有機酸含量測定

按1.3.3中（1）的色譜條件對11個黑糯米酒樣品中10種有機酸測定的結果如表2所示。

由表2可知，乳酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸和檸檬酸是主要的有機酸，這與CAO Y等[15]對黃酒中有機酸的研究結果相符。11個酒樣中只有HMJ6檢出全部10種有機酸，其余樣品中只檢測出部分有機酸，且含量各異，這可能與樣品的原料、工藝等有關。除樣品HMJ3沒有檢測出乳酸外，其余樣品均檢測出乳酸，除HMJ1、HMJ3外，乳酸含量是每個樣品中含量最高的，而HMJ3中含量最高的有機酸則是酒石酸。僅在HMJ1和HMJ6中檢測到琥珀酸，且HMJ1含量較高，琥珀酸能夠使酒體更加醇厚。黑糯米酒中的有機酸主要是由發酵過程中存在的酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等多種微生物通過三羧酸或丙酮酸循環代謝形成。乳酸等有機酸的存在能夠緩解發酵黑糯米酒中乙酸帶來的強烈刺激性，從而賦予黑糯米酒酸味柔和，回味綿長的口感特點。乳酸比較柔和，能給黑糯米酒帶來良好的風味，其香氣雖然微弱，但由于含量較高，對黑糯米酒起到增加醇厚感的作用。同時，在異常情況下，當發酵醪液中的乳酸桿菌和外界侵入的有害菌大量生長繁殖，產生過量的乳酸，致使發酵醪液的酸度上升，抑制正常酵母發酵產酒精，當總酸度＞7.5 g/L時，發酵醪液的香味和口味就變壞，稱為酸敗，因此，乳酸含量對黑糯米酒的品質起著關鍵作用，是生產過程中需要控制的一個重要指標。

本實驗對11種黑糯米酒樣品中的有機酸進行主成分分析（principal component analysis，PCA），計算各個因子得分，對樣品進行綜合評價，結果如圖6所示。從圖6可以看出，11個樣品在第一主成分和第二主成分上勉強區分開，可以被分為4個區域。福建龍巖黑糯米（HMJ1）酒位于圖中PC1負方向區域；廣東梅州黑糯米酒和陜西黑米酒（HMJ2、HMJ3、HMJ6、HMJ7）位于PC1的正方向區域；廣東河源黑糯米酒位于PC2 的正方向區域；貴州黑糯米酒（HMJ9、HMJ10、HMJ11）位于PC2的正方向，主要與乳酸有相關聯，這表明乳酸可以作為貴州黑糯米酒的特征性有機酸以區分其他地域的樣品。

表2 HPLC法測定黑糯米酒中10種有機酸含量Table 2 Contents of 10 organic acids in black glutinous rice wine detected by HPLC

圖6 11種黑糯米酒樣品中有機酸主成分分析Fig.6 Principal component analysis of organic acids in 11 black glutinous rice wine samples

2.3 方法學研究

2.3.1 精密度實驗

按1.3.3中（1）的色譜條件，取有機酸標準母液10 mL于50 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，過0.22 μm水系濾膜后，連續進樣6次，同時對10種有機酸的峰面積進行測定，計算其相對標準偏差值（RSD），儀器精密度實驗結果如表3所示。

由表3可知，10種有機酸的RSD均在0.60%以下，故使用本研究優化的色譜條件測定黑糯米酒中10種有機酸時具有良好的精密度。

表3 精密度試驗結果Table 3 Results of precision tests

2.3.2 重復性實驗結果

取HMJ6黑糯米酒樣品6份，過0.22 μm水系濾膜后在不同時間段（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）分別進樣，色譜條件同1.3.3中（1），測定樣品中10種有機酸的含量，同時計算其RSD。結果如表4所示。

由表4可知，10種有機酸的RSD均在1.00%以下，因而使用該研究優化后的色譜條件測定黑糯米酒中10種有機酸具有良好重復性。

表4 重復性試驗結果Table 4 Results of repeatability tests

2.3.3 加標回收實驗結果

按照1.3.3中（1）的色譜條件進行加標回收率實驗，其結果如表5所示。

表5 加標回收率試驗結果Table 5 Results of standard recovery rate tests

續表

由表5可知，10種有機酸的平均回收率在94.39%～104.73%之間，表明該檢測方法準確度高，因而使用本研究優化的色譜條件測定黑糯米酒中10種有機酸時可以滿足實驗要求。

通過對黑糯米酒中有機酸測定的色譜條件進行優化，建立了黑糯米酒中有機酸快速檢測的方法，即色譜條件：流動相為磷酸二氫鈉溶液濃度0.03 mol/L，不加甲醇，pH值2.90；進樣量10 μL；檢測器為G1315D；ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱溫35 ℃；流速0～4.00 min，流速為1.0 mL/min；4.00～10.00為0.30 mL/min；10.00 min后流速為1.0 mL/min。檢測波長210 nm。與楊成聰[16]建立的HPLC法測定米酒中有機酸的方法有所差異，差異主要表現在流動相、流動相濃度、柱溫、pH值的不同，可能是所用儀器類型及型號和色譜柱的不同，在實驗中也發現，同樣的儀器、色譜柱及相同的條件，不同型號儀器的檢出效果差異很大。同時，與之檢出的7種有機酸相比，本研究建立的方法更優，同時檢出的有機酸種類更多（10種）。此外，與韓曉鵬[17-20]對果酒和獼猴桃酒中有機酸測定的方法比較可知，他們所建立的HPLC法測定有機酸檢測時間較長（20 min），且同時檢測有機酸種類（4種）較少，本實驗所建立的有機酸測定方法可同時分析檢測10種有機酸，且10種有機酸都能在10 min以內完成檢測，達到基線分離。該方法可對黑糯米酒中有機酸進行快速檢測分析，從而提高分析檢測效率，降低實驗成本。

3 結論

研究建立了應用高效液相色譜法測定黑糯米酒中草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、焦谷氨酸和琥珀酸含量的方法。研究表明：檢測器為二極管陣列，檢測波長210 nm，色譜柱：ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為35 ℃，流動相為0.03 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，pH值為2.90，在0～4.00 min，流速為1.0 mL/min；4.00～10.00 min流速為0.30 mL/min；10.00 min后流速為1.0 mL/min。黑糯米酒中的10種有機酸均在10 min內得到有效分離，可以實現黑糯米酒中有機酸含量的快速檢測分析。標準曲線相關系數在0.999 1～1.000，重復性試驗相對標準偏差為0.15%～0.87%，精密性實驗相對標準偏差為0.024%～0.543%，檢出限為0.014 9～0.219 0 mg/L，樣品加標回收率在94.39%～104.73%。應用該方法分析黑糯米酒中有機酸，可知不同酒樣中有機酸種類和含量有所差異，可明確不同酒樣中的主要有機酸。