不同培養(yǎng)介質(zhì)中N-二甲基亞硝胺對(duì)干酪乳桿菌生長(zhǎng)影響

王淑梅，易華西，邸 維，謝玉峰，藺彬彬，張?zhí)m威

（1.哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；3.廣東科貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣東 廣州 510430）

N-亞硝基化合物具有很強(qiáng)的致癌作用，是食源性致癌物之一[1-2]。其中的N-二甲基亞硝胺（N-dimethyl nitrosamine，NDMA）具有最強(qiáng)的致癌能力，能直接損傷組織細(xì)胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），攝入后不需代謝活化即可在消化道接觸部位水解為活性物質(zhì)而誘發(fā)癌癥。

乳酸菌是人體有益菌，在N-亞硝基化合物誘發(fā)人腸道癌變過(guò)程起降低其遺傳毒性作用[3-4]，降低消化道癌癥的發(fā)病率[5-6]。研究表明，乳酸菌可通過(guò)吸附結(jié)合或降解腸道內(nèi)的N-亞硝基化合物[6-8]，或通過(guò)減弱炎癥反應(yīng)而抑制其對(duì)腸黏膜的損傷[9]。如雙歧桿菌可抑制N-亞硝基化合物對(duì)腸道的毒性損傷[7]，而植物乳桿菌顯著降低泡菜中NDMA的含量，抑制NDMA生成[10]。在MRS培養(yǎng)基中，戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）R3顯著降低N-亞硝基化合物的濃度，其菌體細(xì)胞壁表面蛋白降低了22.05%的NDMA，23.31%的N-二乙基亞硝胺（N-diethyl nitrosamine，NDEA）[11]。由于乳酸菌在人體腸道內(nèi)必須保持足夠的數(shù)量，并耐受住胃腸液消化，最終黏附于腸上皮才能發(fā)揮功能[12]。因此，乳酸菌的益生功能與其在腸道內(nèi)存活數(shù)量及停留時(shí)間直接相關(guān)。但是乳酸菌在抑制NDMA毒性作用時(shí)，NDMA對(duì)其生長(zhǎng)是否有影響還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究以干酪乳桿菌SB27為研究對(duì)象，分析其對(duì)胃液、腸液耐受性及腸上皮細(xì)胞黏附性，檢測(cè)NDMA在不同培養(yǎng)介質(zhì)中對(duì)SB27生長(zhǎng)影響，旨在為進(jìn)一步明確干酪乳桿菌SB27降解NDMA及菌株發(fā)揮功能的關(guān)鍵成分提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞和菌株

人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）SB27：分離自甘肅北部的牦牛乳，現(xiàn)保存于哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院。

1.1.2 化學(xué)試劑

N-二甲基亞硝胺（N7756）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒（D2501-01）：美國(guó)Omega公司；青霉素/鏈霉素、胰酶消化液：美國(guó)Corning公司；胎牛血清：杭州四季青有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)Corning公司。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫-80 1.0 mL/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二胺2 g/L，七水硫酸鎂0.58 g/L，三水乙酸鈉5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH 6.2～6.6，于121 ℃高壓滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中添加18 g/L瓊脂，121 ℃高壓滅菌15 min。

低氮源MRS（MRS N）培養(yǎng)基：將MRS液體培養(yǎng)基中的蛋白胨、牛肉膏、檸檬酸氫二胺等含氮成分去掉，并且將酵母浸粉從5 g降為1 g，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HEPA1100二氧化碳培養(yǎng)箱、Forma 102厭氧培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo Electron公司；CX31電子顯微鏡：日本Olympus公司；Sartorius AG PB-10 pH計(jì)：德國(guó)Sartorius公司；3-30K低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；LDZX-40AI高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HWS24數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 磷酸鹽緩沖液及NDMA工作液的制備

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）的制備：磷酸二氫鉀0.24 g/L、磷酸氫二鈉1.42 g/L、氯化鈉8.0 g/L、氯化鉀0.2 g/L，將以上試劑溶解于500 mL蒸餾水中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液校正pH值為6.2～6.3，蒸餾水稀釋至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

將NDMA溶于雙蒸水中，配成10 mg/mL儲(chǔ)備液[13]，4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)中將10 mg/mL儲(chǔ)備液稀釋成1 000 μg/mL工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株活化及活菌計(jì)數(shù)法

在無(wú)菌操作下從已溶解的管中吸取50 μL菌液，滴入裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，輕微振蕩，37 ℃培養(yǎng)18 h，活化2代后備用。

活菌計(jì)數(shù)采用傾注平板法。取適當(dāng)稀釋度的菌液1 mL加入無(wú)菌空培養(yǎng)皿中。將溫度為45～50 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基向已接種菌液的平皿內(nèi)傾注15～20 mL，邊傾注邊搖勻，靜置30 min，翻轉(zhuǎn)使平皿底朝上，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.3.3 菌株SB27益生功能測(cè)定

（1）菌株SB27對(duì)酸耐受能力測(cè)定

依據(jù)WANG S等[14]方法進(jìn)行模擬胃液耐受性實(shí)驗(yàn)。將已活化的干酪乳桿菌SB27培養(yǎng)液離心（5000×g，15min，4℃），預(yù)冷的PBS（pH 7.2）清洗后懸于5 mL模擬胃液[15]中。模擬胃液是經(jīng)鹽酸酸化的PBS（含胃蛋白酶3 mg/mL），pH值分別調(diào)整為1.5、2.0和2.5。采用傾注平板法，在0 h和3 h計(jì)數(shù)菌落數(shù)。以單位體積內(nèi)存活的菌落數(shù)（CFU/mL）對(duì)數(shù)值來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)胃液的耐受性。

（2）菌株SB27對(duì)膽鹽耐受能力測(cè)定

將已活化的干酪乳桿菌SB27培養(yǎng)液離心（5 000×g，15 min，4 ℃），預(yù)冷的PBS（pH 7.2）清洗，懸于5 mL模擬小腸液[15]中。模擬小腸液是含牛膽鹽的PBS（含胰酶1 mg/mL，pH 8），牛膽鹽添加量分別為0.15%、0.30%和0.45%。利用傾注平板法，在0 h和4 h測(cè)定其存活率[14]。評(píng)定方法同上。

（3）菌株SB27黏附性能測(cè)定

將無(wú)菌酸洗玻璃蓋玻片加入6孔組織培養(yǎng)板中，再向每孔加入2 mL的HT-29細(xì)胞懸液（2×105個(gè)/mL），于5%CO2、95%空氣、37 ℃條件培養(yǎng)，至6孔板底部單層細(xì)胞形成，用預(yù)冷的PBS（pH 7.2）清洗細(xì)胞兩次[14]。

取活化好的干酪乳桿菌SB27菌體培養(yǎng)液1mL，加入1mL的RPMI 1640培養(yǎng)液制成2 mL菌懸浮液，加入6孔板中，于上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，預(yù)冷PBS（pH 7.2）清洗，加入2 mL甲醇室溫固定1 h。棄甲醇加入革蘭氏染液，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。記錄視野下100個(gè)HT-29細(xì)胞黏附的干酪乳桿菌SB27細(xì)菌數(shù)，隨機(jī)選取20個(gè)視野，計(jì)算平均值。

1.3.4 NDMA在各培養(yǎng)基中對(duì)菌株SB27生長(zhǎng)影響的測(cè)定

（1）MRS液體培養(yǎng)基

將NDMA工作液加入MRS培養(yǎng)液中，使NDMA終質(zhì)量濃度為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL[16]，對(duì)照組為MRS培養(yǎng)液（0 μg/mL）。將已活化的SB27以4%接種量加入上述培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)168 h，每隔24 h采用傾注平板法計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

（2）MRS N培養(yǎng)基

將NDMA工作液加入MRS N培養(yǎng)液中，使NDMA終質(zhì)量濃度為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL，對(duì)照組為MRS N培養(yǎng)液。將已活化的干酪乳桿菌SB27離心，棄培養(yǎng)液，重新懸于MRS N培養(yǎng)液中，再以4%的接種量加入各實(shí)驗(yàn)組中，培養(yǎng)及計(jì)數(shù)方法同上。

（3）PBS緩沖液

將NDMA工作液加入PBS緩沖液（6.2～6.3）中，使NDMA終質(zhì)量濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL，對(duì)照組為PBS緩沖液。將已活化的干酪乳桿菌SB27離心，去培養(yǎng)液，再用PBS緩沖液清洗菌體2次，以4%接種量加入各實(shí)驗(yàn)組中，培養(yǎng)及計(jì)數(shù)方法同上。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用SAS 9.1軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD），顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SB27胃腸液耐受性

功能性乳酸菌若要在腸道中發(fā)揮作用首先需耐受胃腸道的消化，且能在腸道內(nèi)定植，這是篩選益生菌的首要條件，人體胃、腸道環(huán)境是不斷變化的。空腹時(shí)胃液pH值可低至1.5，進(jìn)食后可升高至6.0[17]。一般情況下，人體胃液pH值為1.5～3.5[18-19]。進(jìn)食1 h內(nèi)，膽鹽添加量變化為1.5%～2.0%，而后下降至0.30%[18-20]。由于食物在胃內(nèi)排空的時(shí)間約為3 h[20]，在小腸內(nèi)排空時(shí)間約為4 h。為保證實(shí)驗(yàn)條件盡可能反應(yīng)出SB27在人體腸道內(nèi)的生存情況，本研究將胃液pH值設(shè)定為1.5、2.0和2.5，膽鹽添加量設(shè)定為0.15%、0.30%和0.45%。菌株SB27在模擬胃液、腸液的生存能力結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株SB27對(duì)模擬胃、腸液的耐受性Fig.1 Tolerance of strain SB27 to simulate gastric and intestinal fluids

由圖1可知，在pH 2.5酸性條件下培養(yǎng)3 h，菌株SB27顯示出最強(qiáng)的生存力（存活率9.55%）；在pH 2.0時(shí)，干酪乳桿菌SB27生存力較低（存活率2.45%）；然而當(dāng)pH 1.5時(shí)，菌株SB27生存力很低，存活率僅為0.26%。有研究顯示，益生菌在pH 1.0和pH 2.0的酸性條件下生存力很低[21]，如雙歧桿菌在pH 2.0的酸性條件下生存能力很弱[22]；但是當(dāng)pH值為3.0時(shí)，菌株的生存能力則增強(qiáng)[21]。因此，一般認(rèn)為乳酸菌可耐受胃液pH 2.5～3.5的酸性環(huán)境[19]。本研究結(jié)果也顯示干酪乳桿菌SB27可耐受胃液pH 2.0～2.5的酸性環(huán)境，但不能耐受胃液pH 1.5的酸性環(huán)境。

膽鹽添加量為0.45%時(shí)，0 h和4 h干酪乳桿菌SB27活菌對(duì)數(shù)值差值（ΔlgCFU/mL）為3.02，菌株SB27存活率＜0.1%，生長(zhǎng)顯著被抑制（P＜0.05）。當(dāng)膽鹽添加量為0.30%時(shí)，培養(yǎng)4 h后SB27的存活率有所提高，為1.66%。而當(dāng)膽鹽添加量減少到0.15%時(shí)，干酪乳桿菌SB27的存活率提高到7.94%，顯著高于膽鹽添加量為0.45%組（P＜0.05）。相比于胃液耐受性，菌株SB27對(duì)膽鹽的耐受性略差些。綜合以上結(jié)果，菌株SB27可耐受胃、腸液的消化，可進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 菌株SB27的黏附性能

本研究選用HT-29細(xì)胞模擬腸道上皮[19]。HT-29細(xì)胞具有人腸上皮細(xì)胞的相關(guān)特性，常被用于黏附能力的測(cè)定[12，23]。益生菌的黏附性能采用黏附值來(lái)評(píng)定，即視野下100個(gè)HT-29細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)，隨機(jī)選20個(gè)視野計(jì)算平均值。若細(xì)菌數(shù)＜40，表示沒(méi)有黏附性；細(xì)菌數(shù)40～100之間，具有黏附性；細(xì)菌數(shù)＞100表示具有強(qiáng)黏附性[24]。

乳酸菌的黏附性能是其發(fā)揮抑菌功能[24]和益生功能的前提條件[25]。人體攝入乳酸菌后，在胃酸、小腸液消化作用下，其生長(zhǎng)繁殖受到一定影響。若乳酸菌具有良好的黏附性能，則能延長(zhǎng)其在人體腸道內(nèi)停留的時(shí)間，有利于菌株的生長(zhǎng)與繁殖，產(chǎn)生更多子代細(xì)胞。BAO Y等[20]依據(jù)菌株耐受胃酸和小腸液能力、黏附能力、抑制致病菌能力等獲得菌株L.fermentumF6。ZHANG Y C等[26]通過(guò)抑菌性能、黏附性能、耐酸和耐膽鹽性能等獲得具有益生功能的菌株L.johnsoniiF0421。本研究結(jié)果顯示菌株SB27黏附值為52.53±1.81，說(shuō)明SB27具有一定的黏附性能，有利于其益生功能的發(fā)揮。

2.3 NDMA在MRS培養(yǎng)基中對(duì)菌株SB27生長(zhǎng)的影響

NDMA在MRS培養(yǎng)基中對(duì)干酪乳桿菌SB27生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同N-二甲基亞硝胺添加量在MRS培養(yǎng)基中對(duì)菌株SB27生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of different N-dimethyl nitrosamine addition on the growth of strain SB27 in MRS medium

由表1可知，培養(yǎng)1～7 d，干酪乳桿菌SB27活菌數(shù)（lgCFU/mL）并未隨著NDMA濃度增加而發(fā)生顯著變化，各組差異均不顯著（P＞0.05）。同時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)在1～3 d內(nèi)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；從第4天開(kāi)始，菌落數(shù)開(kāi)始下降，表明干酪乳桿菌SB27生存能力逐漸下降。第1天，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)均達(dá)到108個(gè)CFU/mL；與第1天相比，各組菌落數(shù)在第2天均有顯著增加（P＜0.05），最高增加了7.24倍（20 μg/mL組），最低增加了2.57倍（40 μg/mL組），對(duì)照組菌落數(shù)增加3.09倍；第2～3天，僅對(duì)照組、5 μg/mL、10 μg/mL和40 μg/mL組菌落數(shù)緩慢增加，分別增加了1.48、1.32、1.15、1.23倍；第3～7天，菌株生存能力逐漸下降，培養(yǎng)至第7天，各組菌落數(shù)均下降到第3天的0.2%以下。

NOWAK A[16]報(bào)道，含有NDMA的MRS中培養(yǎng)24 h，Lb.rhamnosus0908活菌數(shù)達(dá)109個(gè)CFU/mL，NDMA（2～100 μg/mL）對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。本研究結(jié)果表明，在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～7 d，對(duì)照組與NDMA各劑量組菌落數(shù)具有相似的變化趨勢(shì)，劑量組間差異不顯著（P＞0.05），表明在MRS培養(yǎng)基中NDMA（0～80 μg/mL）對(duì)干酪乳桿菌SB27生長(zhǎng)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.4 NDMA在MRS N培養(yǎng)基中對(duì)菌株SB27生長(zhǎng)的影響

由表2可知，在MRS N培養(yǎng)基中，干酪乳桿菌SB27生長(zhǎng)受到一定程度抑制，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)（0～7 d）活菌數(shù)呈指數(shù)下降趨勢(shì)。培養(yǎng)1～2 d，各組SB27菌落數(shù)差異不顯著（P＞0.05），菌落數(shù)不隨NDMA劑量增加而發(fā)生顯著變化。培養(yǎng)至第3天，所有組活菌數(shù)均降至第1天的0.2%以下，對(duì)照組活菌數(shù)顯著低于NDMA實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。這說(shuō)明干酪乳桿菌SB27在無(wú)N源培養(yǎng)基中被迫利用NDMA的N源維持生長(zhǎng)。培養(yǎng)至第4天，所有組活菌數(shù)極低，對(duì)照組與NDMA實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)差異顯著（P＜0.05）；隨著NDMA劑量增加（5～40 μg/mL），干酪乳桿菌SB27活菌數(shù)增加，但80 μg/mL組活菌數(shù)又下降。培養(yǎng)至第5天，對(duì)照組已檢測(cè)不出活菌落，其他實(shí)驗(yàn)組的活菌檢出數(shù)均低于100個(gè)CFU/mL，5 μg/mL和80 μg/mL組活菌數(shù)低于10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL。

表2 不同N-二甲基亞硝胺添加量在MRS N培養(yǎng)基中對(duì)菌株SB27生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of different N-dimethyl nitrosamine addition on the growth of strain SB27 in MRS N medium

GRILL J P等[27]研究顯示，在TPY培養(yǎng)液（胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸提物）中，NDMA（2～200 μg/mL）對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌BB536生長(zhǎng)（0～24 h）沒(méi)有顯著影響。TPY為含N源但無(wú)刺激因子的培養(yǎng)基，說(shuō)明無(wú)刺激因子條件下長(zhǎng)雙歧桿菌仍能存活，但是該研究并未能解釋乳酸菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏情況下能否有效利用NDMA來(lái)維持生長(zhǎng)。由于NDMA并不能提供乳酸菌生長(zhǎng)所需的刺激因子，因此，本研究將MRS改成低N源但有刺激因子的培養(yǎng)基，考察干酪乳桿菌SB27是否利用NDMA中的N源維持生長(zhǎng)。由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，低N源MRS培養(yǎng)基迫使干酪乳桿菌SB27利用NDMA的N維持基本生長(zhǎng)，當(dāng)?shù)蛣┝拷MNDMA的N源被耗盡，干酪乳桿菌SB27的存活力也逐漸下降，而高劑量的NDMA又顯示出對(duì)干酪乳桿菌SB27的毒性作用。

2.5 NDMA在PBS緩沖液中對(duì)菌株SB27生長(zhǎng)的影響

表3 不同N-二甲基亞硝胺添加量在PBS緩沖液中對(duì)菌株SB27生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of different N-dimethyl nitrosamine addition on the growth of strain SB27 in phosphate buffer

由表3可知，在PBS中，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)各組活菌落數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)下降趨勢(shì)；但隨著NDMA劑量的增加，菌株SB27活菌落數(shù)并未發(fā)生顯著變化，無(wú)劑量依賴性。培養(yǎng)至第4天，各組的活菌落數(shù)均低于100個(gè)CFU/mL。而培養(yǎng)至第5天，空白對(duì)照組和NDMA實(shí)驗(yàn)組均無(wú)活菌落檢出。結(jié)果表明，NDMA在PBS緩沖液（pH 6.2～6.3）中對(duì)干酪乳桿菌SB27生長(zhǎng)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本研究對(duì)分離自甘肅牦牛乳并具有潛在益生功能的干酪乳酸菌（Lactobacillus casei）SB27進(jìn)行胃液、腸液耐受性及腸上皮細(xì)胞黏附性能研究；同時(shí)又分析在不同培養(yǎng)介質(zhì)中NDMA對(duì)干酪乳酸菌SB27生長(zhǎng)存活的影響。研究結(jié)果顯示，干酪乳酸菌SB27可耐受模擬胃、腸液的分解；具有良好的黏附性能；在MRS、MRS N、PBS培養(yǎng)液中，NDMA對(duì)干酪乳酸菌SB27生長(zhǎng)及存活沒(méi)有顯著影響。說(shuō)明干酪乳桿菌SB27具有一定益生功能，且不受NDMA的毒性損傷，為后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)。接下來(lái)可對(duì)干酪乳桿菌SB27進(jìn)行降低NDMA濃度或毒性影響的研究，并進(jìn)一步探究干酪乳桿菌SB27發(fā)揮此功能的關(guān)鍵因子。