金刺梨發酵前后風味物質變化研究

林 靈 ，王 瑜，楊 娟，楊小生，周 美，王道平，張 頎

（1.貴州醫科大學 藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014；2.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014；4.貴州省安順市西秀區科學技術局，貴州 安順 561000）

金刺梨（Rosa sterilis）又稱無籽刺梨，是一種早產、高產、根系發達、生長旺盛的果樹，也是一種食藥兼用的綠色保健食品，為貴州省特有種系，具有較高的營養和保健價值，有“新山珍”之稱，果實中富含維生素C、葉酸、胡蘿卜素、超氧化物歧化酶、人體所必需氨基酸等，同時還含有抗白血病的天門冬氨酸，還具有抗氧化能力[1]。金刺梨是具有極大開發利用價值的第三代野生果樹，其鮮果的口感比刺梨更佳，香氣更濃郁，食之延年益壽，為人體營養、保健佳品[2]。目前，貴州省安順市對金刺梨進行了大面積的種植栽培，急需對其深加工與新產品開發研究[3]。而近年來對金刺梨的研究多是對比其與刺梨的區別研究為主，付曉慧等[4]研究了刺梨與金刺梨的主要化學成分的區別，得出二者所含的化學成分存在差異是導致口感差異的原因，吳洪娥等[5]對金刺梨和刺梨基本營養成分進行了對比研究，得出主要營養成分維生素C、蛋白質、維生素E、維生素B2及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）都存在差異，另外魯敏等[8]對金刺梨與刺梨果實中氨基酸組成和含量進行比較研究，也探究了金刺梨與刺梨果實中水解氨基酸與游離氨基酸的組成和含量，結果表明，精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸與鳥氨酸對刺梨果實獨特風味的形成有較高貢獻，而金刺梨果實中僅天冬氨酸的含量閾值比超過1，形成其鮮味，目前還沒有對金刺梨發酵后香氣的研究。

本課題組對普通刺梨經過發酵處理工藝處理后，發現酯類、醇類和酸類物質是其特征性風味物質[6]，也有對普通刺梨果渣經過不同菌種發酵后香氣成分的分析，發現醇類和酯類是區分不同菌種發酵刺梨果渣的香氣的主要因素，經過不同菌種發酵后，刺梨果渣風味改變顯著[7]。以上研究都是基于金刺梨與普通刺梨成分的對比研究，而對于金刺梨新產品開發的相關研究幾乎空白。因此，本研究以金刺梨為原料，探究金刺梨的游離氨基酸、有機酸和揮發性風味成分經過發酵工藝處理前后的變化，以期為金刺梨發酵產品生產過程中的質量控制提供數據參數，為金刺梨深加工與綜合開發利用以及產業的發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金刺梨：貴州安順市貴州大興農業科技發展有限公司；白糖：市售；纖維素酶（酶活2 000 U/g）：南寧龐博生物科技有限公司提供；發酵劑：貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室自制；硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；有機酸標準品（草酸、檸檬酸、蘋果酸、L-乳酸、醋酸）（純度＞99%）：貴州迪大生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

L-8800全自動氨基酸分析儀：日本HITICHI公司；HP6890/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫公司；手動固相微萃取裝置：美國Supelco公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；SKG-PB-936打漿機：上海達瑞寶公司；BS-210S型電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；GZX-9420MBE鼓風烘箱、BZF-50真空干燥箱：上海博迅實業有限公司；Millipore-0026型超純水機：美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 金刺梨發酵方法

取新鮮金刺梨洗凈去蒂，按照一份鮮果，二份純凈水打漿混合后，得到金刺梨果漿，此時的果漿作為發酵前的樣品，按照果漿總質量的10%添加白糖，攪拌使白糖完全溶化，按照其總質量的0.02%添加纖維素酶，按照其總質量的0.03%添加發酵劑粉末，將發酵劑加入到35～40 ℃的含糖量為10%的糖水中攪拌5～10 min進行活化，混合均勻后將其轉至陶瓷壇內，陶瓷壇采用100目紗布封口，在18～25 ℃溫度條件下有氧發酵。待發酵3個月后，pH降至3～4，糖度降至4%～5%，產品澄清透明，呈淡黃色，結束發酵，取樣作為發酵后的樣品。

1.3.2 氨基酸的測定

參照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的測定方法》，準確稱取5 mL金刺梨樣品溶液，加入6 mol/L鹽酸于水解管中，在充氮氣狀態下封口，將已封口的水解管放在（110±1）℃的恒溫干燥箱內，水解22 h后，取出冷卻。打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉移到50 mL容量瓶內，用1 mL pH2.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。準確吸取0.20 mL混合氨基酸標準液溶，用pH 2.2的緩沖液5 mL，此標準稀釋液濃度為5.00 nmol/50 μL，作為上機測定用的氨基酸標準，用氨基酸自動分析儀以外標法測定試樣測定液的氨基酸含量。

1.3.3 有機酸的測定

采用高效液相色譜法，其中色譜條件：Carbomix H-NP色譜柱（7.80 mm×300 mm，10 μm），柱溫：55 ℃，光學部件溫度：55℃；室溫；流動相：2.50mmol/LH2SO4；流速：0.50mL/min；進樣體積：10 μL；標準曲線的繪制：分別取草酸、檸檬酸、蘋果酸、L-乳酸、醋酸適量，精密稱量，用流動相溶解并定容至5 mL，再分別精密吸取各對照品1 mL進行混合，得到質量濃度分別為160 μg/mL、152.10 μg/mL、161.30 μg/mL、158.40 μg/mL、166.80 μg/mL的草酸、檸檬酸、蘋果酸、L-乳酸、醋酸混合對照品溶液，精確量取對照品儲備液進行不同比例稀釋，制得5個不同質量濃度對照品。精密吸取5 μL分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制得到有機酸標準曲線；通過保留時間對比法，確定有機酸的出峰順序，金刺梨酵素樣品過0.45 μm的過濾膜后上機檢測。

1.3.4 揮發性成分的測定

參照王振斌等[9]對發酵產品的揮發性成分的測定方法進行改進優化，采用固相徽萃取-氣質聯用（solidphasemicroextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GCMS）技術對金刺梨發酵工藝前后的揮發性成分進行檢測。將發酵前后的金刺梨果漿混合均勻后取5 mL，置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有萃取纖維頭的手動進樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取48 min，熱解吸5 min后進樣進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫45 ℃，保持2 min，以5 ℃/min-升溫至270 ℃，運行時間72 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（99.999%）；柱前壓16.32psi，載氣流量1.0mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間3 min。質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.60 μA；倍增器電壓1 847 V；接口溫度280 ℃；質量掃描范圍29～500 amu。采用GC-MS工作站軟件對照Wiley275和美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）17標準數據庫進行分析，通過譜庫檢索和揮發性成分的質譜碎片信息、保留指數、保留時間等進行定性分析；采用面積歸一法進行相對含量統計。

1.3.5 數據處理

利用Excel 2018進行標準曲線、相關系數和線性方程計算或模擬應用SPSS 21.0軟件進行差異顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 金刺梨發酵前后氨基酸的變化

氨基酸是蛋白質的主要組成成分，食品中氨基酸的種類和含量是衡量其營養質量和感官呈味的一項重要指標[10]。它可以增強食品的滋味特性來刺激消費者的味覺，也可以間接參與風味的體現[11-12]。參照香氣活性值（aroma activity value，OAV）[13]（表示各個呈味物質的含量與其閾值的比），由此確定主要呈味的氨基酸，根據游離呈味氨基酸的分類方法將水解氨基酸分為鮮味氨基酸，甜味氨基酸，芳香味氨基酸，苦味氨基酸四種[14]。氨基酸是不僅是重要的營養物質[15]，而且氨基酸可與多種味覺受體作用，體現出豐富的味感，不同氨基酸組合成為特征性的鮮味[16]。在食品的呈味方面扮演著十分重要的角色[17]。天冬氨酸、谷氨酸為鮮味氨基酸，胱氨酸為芳香氨基酸[18]，組氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸為甜味氨基酸，異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸則為苦味氨基酸[19]。

表1 金刺梨發酵前后氨基酸含量變化Table 1 Changes of amino acid content before and after fermentation of Rosa sterilis

由表1可知，金刺梨經發酵工藝前后的水解氨基酸的種類和含量如表1所示，金刺梨發酵前含有17種氨基酸，其中含有3種鮮味氨基酸，7種甜味氨基酸，3種芳香味氨基酸，4種苦味氨基酸，發酵后含有12種氨基酸，其中含有1種鮮味氨基酸，5種甜味氨基酸，3種芳香味氨基酸，3種苦味氨基酸。氨基酸總含量與數量均有所降低，其中鮮味氨基酸含量占總氨基酸的由原來的27.43%降至2.51%，鮮味氨基酸含量占總氨基酸的比例降低了24.92%；但是甜味氨基酸含量占總氨基酸由原來的36.84%上升至42.62%，苦味氨基酸含量占總氨基酸由原來的33.82%上升至41.78%，芳香味氨基酸含量占總氨基酸由原來的1.9%上升至13%；發酵后的甜味氨基酸，苦味氨基酸，芳香味氨基酸含量占總氨基酸的比例分別提高了5.78%，7.96%，11.1%。苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，當其含量低于呈味閾值時，可增強其它呈味氨基酸的鮮味和甜味[20]。發酵后未檢測出異亮氨酸，可能是被乳酸菌酵解并形成了揮發性風味物質。發酵后氨基酸含量減少，可能是因為氨基酸在微生物和酶的作用下形成α-酮酸，然后被脫羧而轉化為乙醛，接著被脫氫形成乙醇或羧酸[21]，最終轉化為對整體香味有益的芳香類酯類物質。

2.2 金刺梨發酵工藝處理前后有機酸的變化

采用高效液相色譜法，通過與照品保留時間對比，得到的有機酸依次為草酸、檸檬酸、蘋果酸、L-乳酸、醋酸。金刺梨發酵前，金刺梨發酵后以及對照品的高效液相圖譜如圖1所示，經過一元線性回歸得出各有機酸標準曲線回歸方程如表2所示，結果表明各有機酸在各自進樣量范圍內線性關系良好。

有機酸酸類是形成酯類的前體物質，它可以構成其他香味物質，其對金刺梨酵素風味的重要性僅次于酯類。同時，有機酸是重要的味感物質，它可使得酵素口感豐滿。采用外標法測定其有機酸種類及含量，結果見表3。

從表3中可以看出，金刺梨發酵前后有機酸種類和含量均發生了顯著變化，發酵后新增的有機酸包括蘋果酸，乳酸，醋酸三種，另外原有的檸檬酸含量發酵后是發酵前的3.42倍，蘋果酸含量增長7.51倍。分析金刺梨酵素后的有機酸組成可知，醋酸含量最高，達到17 477.80 mg/kg，這與發酵過程中微生物的作用密切相關，醋酸菌以酒精為基質，在有氧條件下，將乙醇脫氫生成乙醛，再生成醋酸，醋酸作為金刺梨酵素的主體物質。其次，檸檬酸含量較高，這使得金刺梨酵素的酸味長，口感好[22]。蘋果酸、乳酸具有緩沖作用，并融合和協調金刺梨酵素中的糖分、氨基酸和香氣成分，使得金刺梨酵素的酸味柔和，味道醇和。草酸和L-乳酸等含量相對較少，是金刺梨酵素中輔助酸味的有機酸，這形成了金刺梨酵素豐富的酸味味感。金刺梨酵素中豐富的有機酸對其營養價值有重要貢獻，研究表明有機酸對人體腸道微生態的調節具有重要作用[23]，從風味角度分析，金刺梨酵素中有機酸以醋酸為主，配合其他種類的有機酸的輔助，使金刺梨酵素產品味覺持久性得以延伸，口感飽和度柔和鮮爽、體現出豐滿、爽快、持久和層次感。

圖1 金刺梨發酵前（a）、發酵后（b）、對照品（c）的有機酸含量測定HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of organic acid contents detection of Rosa sterilis before fermentation (a),after fermentation (b)and standards (c)

表2 五種有機酸的線性關系考察結果Table 2 Results of linear relationship of five organic acids

表3 金刺梨發酵前后有機酸含量Table 3 Organic acids contents of Rosa sterilis before and after fermentation

2.3 金刺梨發酵工藝處理前后揮發性成分的變化

圖2 金刺梨發酵前（A）和發酵后（B）揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components before (A) and after (B) fermentation of Rosa sterilis analysis by GC-MS

表4 金刺梨發酵前后揮發性化合物檢測結果Table 4 Determination results of volatile compounds in Rosa sterilis before and after fermentation

續表

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從表4可知，金刺梨發酵前后的揮發性香氣成分在種類和含量上發生了顯著性變化，金刺梨發酵前檢出98種揮發性成分，包括醇類（14種）相對百分含量占22.22%，醛類（14種）相對百分含量占2.39%，酯類（20種）相對百分含量占4.11%，酮類（12種）相對百分含量占1.13%，酸類（11種）相對百分含量占50.74%，烷烯烴類（17種）相對百分含量占2.31%，其他類（10種）相對百分含量占0.73%，金刺梨發酵后檢出95種揮發性成分，包括醇類（15種）相對百分含量占46.02%，醛類（6種）相對百分含量占0.65%，酯類（36種）相對百分含量占36.63%，酮類（6種）相對百分含量占0.20%，酸類（9種）相對百分含量占2.66%，烷烯烴類（14種）相對百分含量占0.90%，其他類（9種）相對百分含量占3.80%。由以上數據可知，金刺梨發酵處理以后，含量發生顯著變化的有酸類、醇類、酯類；其中醇類和酯類的相對含量百分比分別增加了23.79%，32.52%，而酸類、醛類和酮類相對含量百分比分別降低了48.08%、1.73%、0.93%。醇類是酵母菌發酵的主要代謝產物，風味方面多呈現出清新的花草香氣，其中乙醇含量顯著增加，乙醇被賦予蘋果甜香的風味特征[24]，可有效的增加金刺梨酵素的香甜風味。酯類化合物是芳香風味的代表，發酵后，乙酸乙酯、己酸乙酯的含量明顯增加，而乙酸乙酯被賦予果香和酯香屬性[25]；己酸乙酯具有水果香味，具有曲香和菠蘿香型香氣[26]；顯著提升了金刺梨酵素的芳香風味。同時產生了新的芳香酯類化合物，如具有蘋果香味[27]的順式-4-辛烯酸乙酯、帶有明顯的玫瑰、橙子香氣[28]的壬醛酯，以及對刺激性味感具有緩沖作用的乳酸乙酯[29]。其中含量顯著降低的是酸類和醛類化合物，酸類化合物中己酸和辛酸含量顯著降低，相對百分含量分別32.2%、15.2%降至0.95%、0.72%，有研究表明己酸作為己酸乙酯的前提物質，是濃香型白酒中最重要的香氣成分[30]，低含量的己酸在水果中表現出一定的芳香味，但是高濃度的己酸會導致刺激性酸味[31]，可知己酸經過發酵后轉化為具有芳香風味的己酸乙酯，醛類化合物經發酵工藝后也明顯降低，同樣高濃度的醛類物質會帶來異味[32]，但經發酵后，醛類物質因不穩定，被還原為醇或者氧化為酸[33]。

3 結論

本研究通過對金刺梨發酵前后的呈味呈香物質的變化進行分析研究。可知金刺梨經過酵素化處理后，氨基酸總含量與數量均有所降低，但發酵后的甜味氨基酸，苦味氨基酸，芳香味氨基酸含量占總氨基酸的比例相對提高；有機酸含量和數量均增加，發酵處理后新增的有機酸包括蘋果酸、乳酸、醋酸三種，新產生的有機酸使金刺梨酵素味覺持久性得以延伸，口感飽和度柔和鮮爽、體現出豐滿、爽快、持久和層次感；揮發性風味物質變化顯著，其中醇類和酯類的相對含量百分比的增加賦予了金刺梨酵素特有的果香和酯香屬性，而酸類和醛類酮類相對含量的降低緩解了金刺梨因高濃度的酸類和醛類而導致的刺激性的酸味和不愉悅的異味。以上結果更有力的為金刺梨在新產品開發中利用發酵工藝的可行性提供了數據支撐，后期將進一步的從功能功效和營養吸收等方面分析發酵工藝在果蔬產品開發中的優勢，為酵素產業的發展提供理論支撐。