不同釀酒酵母對山葡萄北國藍蒸餾酒揮發(fā)性物質的影響

謝蘇燕，舒 楠，金宇寧，肖家美，路文鵬

（中國農業(yè)科學院 特產研究所，吉林 長春 130112）

水果烈酒又叫水果蒸餾酒，是指以新鮮水果或果汁為原料，經過發(fā)酵、蒸餾、貯存而成的飲料酒[1]。影響蒸餾酒品質的主要因素有釀酒原料的地理產區(qū)、原料品種、酵母菌種、蒸餾工藝等，其中最主要的因素之一是釀酒酵母的選擇，因為酵母菌可以將葡萄果實內的大部分糖轉化為酒精和二氧化碳，并且在發(fā)酵期間生成甘油、高級醇、酯類、醛類等香氣物質，可以說酵母菌是葡萄酒的靈魂[2-5]。目前為止，已發(fā)現的存在于葡萄果實、葡萄醪及葡萄酒中的酵母菌有120種，屬于24個屬，常見的有酵母屬、梅奇酵母屬、類酵母屬、結合酵母屬等，幾乎遍及酵母的主要屬種[6]。

山葡萄北國藍，原代號88100，由中國農業(yè)科學院特產研究所選育，于2015年通過吉林省農作物品種審定，并命名為“北國藍”[7]。北國藍作為東北地區(qū)主栽的山葡萄品種之一，具有抗寒抗病性強、豐產穩(wěn)產性高的特點[8]。北國藍漿果具有高酸、高單寧、低糖、弱香氣的特點，使得單品種釀造的葡萄酒也具有酸高、糖低的特性，很少直接飲用，平時多用來調酸調色，但這正好符合葡萄烈酒對原料的要求[9-10]。

本實驗選用北國藍作為試驗材料，通過分析比較不同酵母發(fā)酵的蒸餾酒香氣成分的種類和含量，從而得到適合釀造山葡萄烈酒的釀酒酵母，對適合釀造山葡萄蒸餾酒的酵母菌進行初步探討，有利于山葡萄蒸餾酒的開拓，并為山葡萄蒸餾酒的后續(xù)研究提供了一些參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山葡萄北國藍：吉林省吉林市左家鎮(zhèn)山葡萄試驗園，種植株行距為1.0 m×2.5 m，籬架式，5年生。

8種安琪活性干酵母（CEC01、BV818、RV171、VIC、MST、ADT、VF、OFR）：安琪酵母股份有限公司。

硫酸（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠；蒽酮、鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：上海滬試實驗室器材股份有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；葡萄糖（分析純）：廣州金華大化學試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Cary 60 UV-Vis 紫外分光光度計：安捷倫科技有限公司；PAL-06型手持折光儀：日本ATAGO公司；ALB-124電子分析天平：德國賽多利斯公司；FlavourSpec風味分析儀：德國GAS公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；FD-1C-50真空冷凍干燥箱：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山葡萄北國藍蒸餾酒釀造操作要點

采樣：結合北國藍的成熟期與2018年吉林省吉林市左家鎮(zhèn)的氣候條件，選擇在9月14日采樣并進行釀酒試驗，為了保證采樣具有代表性，在北國藍試驗區(qū)選40棵樹，在每棵葡萄樹的上、中、下隨機摘取穗葡萄，取樣總量為80 kg。

釀造：采回的葡萄挑去病果、爛果后，留3穗葡萄考種，其他進行人工去梗、破碎，加入8種安琪活性干酵母（250 mg/L）均分于8個20L的玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵7 d，發(fā)酵溫度設為18℃。發(fā)酵結束后，留取200 mL樣品，測定葡萄酒的各理化指標。

蒸餾：發(fā)酵結束后的葡萄醪用12 L的帝伯仕小型實驗室用蒸餾器進行蒸餾，流程如下：

陳釀：將裝瓶的蒸餾酒（澄清透明，酒精度為44%vol），放置在10～20 ℃、恒濕（50%）、陰暗條件下密封保存6個月，然后進行成分檢測分析。

1.3.2 理化指標的測定方法

葡萄果實、葡萄酒及蒸餾酒酒的理化指標：參照參考文獻[11-12]的方法測定。

1.3.3 香氣成分的測定方法

采用頂空-氣相色譜法對山葡萄北國藍蒸餾酒的揮發(fā)性香氣成分進行測定[13]：取1 mL酒樣，每個樣重復3次，置于20 mL頂空瓶中，加入10 μL 20 mg/L 的4-甲基-2-戊醇（內標），60 ℃孵育10 min后進樣。內標法定量分析。

1.3.4 數據處理

運用SAS數據分析軟件，進行方差分析、主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同釀酒酵母對蒸餾酒可溶性固形物的影響

圖1 不同釀酒酵母對山葡萄北國藍蒸餾酒可溶性固形物的影響Fig.1 Effect of different Saccharomyces cerevisiae on the soluble solid contents of Vitis amurensis Beiguolan distilled spirits

由圖1可知，發(fā)酵期間，葡萄醪的可溶性固形物都呈下降趨勢，下降速率因酵母不同而有差異。酵母CEC01起發(fā)最快，而且可溶性固形物下降得最快，ADT次之，但在第3天，ADT的可溶性固形物下降速率高于CEC01，BV818的下降速率僅次于前兩者，其次是RV171、MST、VF、VIC，OFR的下降速率是最慢的。發(fā)酵結束時，RV171的殘?zhí)亲罡撸瑸?.1%，CEC01最低，為6.3%。總體來看，酵母CEC01發(fā)酵速度快，發(fā)酵徹底；酵母ADT起發(fā)較快，發(fā)酵速率最快，發(fā)酵徹底。

2.2 不同釀酒酵母對蒸餾酒理化指標的影響

表1 不同釀酒酵母對山葡萄北國藍蒸餾酒的理化指標比較Table 1 Comparison of physicochemical indexes between Vitis amurensis Beiguolan distilled spirits by different Saccharomyces cerevisiae

由表1可知，用8種不同的酵母發(fā)酵的蒸餾酒還原糖范圍為1.38～2.23 g/L，發(fā)酵完成，其中用酵母RV171發(fā)酵的蒸餾酒還原糖為（2.23±0.26）g/L，顯著高于其他7種酵母（P＜0.05），用MST發(fā)酵蒸餾酒的還原糖為（1.38±0.40）g/L，顯著低于其他酵母（P＜0.05）。

用8種不同酵母發(fā)酵的蒸餾酒總酸范圍為16.43～18.09 g/L，均低于原料山葡萄北國藍漿果的總酸（23.45 g/L），說明8種酵母均有一定的降酸能力。其中用酵母ADT發(fā)酵的蒸餾酒總酸為（18.09±0.11）g/L，顯著高于其他7種酵母（P＜0.05），其次是VF、CEC01、BV818，OFR發(fā)酵的蒸餾酒總酸為（16.45±0.10）g/L，顯著低于其他酵母（P＜0.05）。

用8種不同的酵母菌發(fā)酵的蒸餾酒酒精度為9.65%vol～9.80%vol，用酵母MST發(fā)酵的蒸餾酒酒精度為9.80%vol，發(fā)酵最徹底，產酒能力顯著優(yōu)于其他酵母（P＜0.05），其次是CEC01，酵母BV818發(fā)酵的蒸餾酒酒精度最低，為9.65%vol。

2.3 不同釀酒酵母對蒸餾酒揮發(fā)性香氣成分的影響

2.3.1 不同釀酒酵母發(fā)酵的蒸餾酒香氣成分的定性定量分析

由表2可知，用該方法共檢測到29種揮發(fā)性香氣物質，包括16種酯類、8種醇類、2種醛類和3種酮類。醇類和酯類氣組分含量高，占總香氣成分含量的91.59%～93.4%，這與前人所研究的主要香氣成分占比相符合[14-15]。酵母CEC01發(fā)酵的蒸餾酒中揮發(fā)性物質含量最高，為16 394.235 μg/L，其次為酵母VF（16 163.22 μg/L）、ADT（15 576.32 μg/L）、MST（14 970.34 μg/L）、OFR（14 914.04 μg/L），酵母BV818發(fā)酵的蒸餾酒中揮發(fā)性物質總含量最低，為13 783.04 μg/L。

該實驗中，酯類物質占香氣總含量的比例為23.2%～36.96%，主要在發(fā)酵和蒸餾過中醇類與有機酸通過酯化作用生成，具有果香和花香，是葡萄酒中最活躍的物質[16]。酒樣中共檢16種酯類物質，其中乙酯類10種，己酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸乙酯含量較高，且具有蘋果、香蕉、菠蘿等果香，是蒸餾酒香氣成分組成中有不可或缺的作用[17]；有6種乙酸酯，其中乙酸異戊酯為蒸餾酒提供香蕉香氣且含量明顯高于其他幾種。8種類型釀酒酵母發(fā)酵的山葡萄蒸餾酒中，酵母VF發(fā)酵的蒸餾酒中酯類物質含量最高，為5 974.699 μg/L，占香氣總含量的36.96%，其次是酵母CEC01（5426.388μg/L）、ADT（4 627.19 μg/L）、MST（4 293.878 μg/L），含量最低的是酵母VIC（3 202.575 μg/L）。

醇類主要來自于發(fā)酵過程中酵母代謝產生、其次也來源于糖苷類前體和酯類分解等[18]。該實驗共檢測出醇類物質8種，占總香氣含量的54.63%～70.85%，含量最高且具有特殊香味，是烈酒香氣成分中必不可少的。不同釀酒酵母發(fā)酵的蒸餾酒醇類物質的種類相同、含量各異，8種蒸餾酒中異戊醇、2-甲基-1-丙醇、D-正己醇含量最多，其中異戊醇具有青草、吐司味，是酵母菌代謝的產物；2-甲基-1-丙醇具有麥芽香，在蒸餾酒香氣中有重要貢獻[19]；D-正己醇賦予酒青草香、吐司味，且高級醇是某些酯類物質的前體物質，對呈香具有重要作用，將會提高酒的感官品質。三者的含量占總醇類含量的72.13%～78.55%，是蒸餾酒中主要的醇類呈香物質。其中酵母ADT發(fā)酵的蒸餾酒中異戊醇和D-正己醇的含量（分別為1 014.88 μg/L、4 670.382 μg/L）高于其他幾種酵母，其次是酵母CEC01（分別為4 601.746 μg/L、991.411 μg/L）；酵母OFR發(fā)酵的蒸餾酒中2-甲基-1-丙醇的含量最高，為1708.929μg/L，其次是酵母CEC01（1671.072μg/L）、ADT（1 634.422 μg/L）。

山葡萄蒸餾酒中除了前面所述的兩大類香氣物質外，還檢測到少量其他物質（如糠醛、丙酮、2,3-丁二酮等）。山葡萄蒸餾酒中的醛酮類物質的來源有以下幾種：來源于水果本身、產生于蒸餾酒釀造的整個過程、在陳釀時由其他物質轉化而來，這些物質對蒸餾酒的風味有著極重要的作用，主要提供堅果味和過熟的蘋果味，是其前香的重要組成部分[20-21]。共檢測出5種醛酮類物質，占總香氣含量的6.56%～8.33%，其中糠醛為酒體提供苦杏仁味，2,3-丁二酮提供奶油味。酵母ADT發(fā)酵的蒸餾酒中糠醛含量最高（140.924μg/L），其次是酵母MST（127.138μg/L）；酵母CEC01發(fā)酵的蒸餾酒中酮類物質含量最高（960.434 μg/L），其次是酵母VIC（958.014 μg/L）。

2.3.2 不同釀酒酵母發(fā)酵的蒸餾酒香氣成分的主成分分析

僅憑香氣成分的含量進行分析具有一定的片面性，香氣成分之間的相互作用對葡萄蒸餾酒香氣品質的影響考慮的不夠充分全面，為了進一步驗證不同品種葡萄蒸餾酒的香氣品質，本研究參考了沈靜等[22]的主成分建模方法。首先將檢測到的29種香氣成分分為酯類（X1）、醇類（X2）、醛類（X3）、酮類（X4）4個類型，以8種不同釀酒酵母發(fā)酵的蒸餾酒的4類揮發(fā)性香氣成分為指標構成8×4的矩陣，使用SAS軟件進行分析。不同酵母發(fā)酵的蒸餾酒中4類香氣成分的特征值及方差貢獻率見表3，主成分因子載荷矩陣見表4。

表4 主成分因子載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components factors

由表3可知，前3個主成分的累計方差貢獻率達到97.56%，可以有效解釋所有變量的信息，故可以將這3個主成分作為香氣數據分析的有效成分。同時根據3個主成分的特征向量，可以用Z1、Z2、Z3這3個新的綜合指標來代替5種香氣成分，進行綜合評價，以下是8個不同酵母發(fā)酵的蒸餾酒香氣物質的線性關系：

主成分Z1、Z2、Z3從不同方面反映了8種不同蒸餾酒的香氣成分，但若只采用其一，則難以對蒸餾酒進行綜合評價。因此，可用Z1、Z2、Z3在方差貢獻率作為權重數，計算主成分因子的權重，公式如下：

由表4計算可知，主成分因子1、2、3的權重分別是0.415、0.393、0.192，然后對Z1、Z2、Z3加權，得到不同酵母菌發(fā)酵的蒸餾酒的揮發(fā)性香氣成分的綜合得分（Z），公式如下：

對8種不同酵母發(fā)酵的蒸餾酒進行綜合分析，結果見表5。

表5 主成分的綜合得分Table 5 Composite score of principal components

由表5可知，第1主成分綜合得分最高的是酵母ADT發(fā)酵的蒸餾酒（1.707 09），第2主成分得分前兩位的分別是酵母CEC01和RV171發(fā)酵的蒸餾酒（1.369 33和0.358 89），第3主成分得分最高的是酵母VIC發(fā)酵的蒸餾酒（1.496 09）。在香氣綜合得分中，酵母CEC01發(fā)酵的蒸餾酒得分最高（0.426 012），ADT發(fā)酵的蒸餾酒（0.410 39）稍低于酵母CEC01，其次是酵母MST（0.338 028）、BV818（0.250 197）、VIC（0.011 313），這5種酒樣的綜合得分＞0，說明其整體香氣質量在8種酒樣的平均水平之上。相比較而言，酵母CEC01、ADT發(fā)酵的蒸餾酒品質較好，這與對香氣成分定性定量分析的結果相差不大。

3 結論

優(yōu)質的菌株是果酒加工的核心要素之一，是保證酒質與產量的關鍵。本實驗主要進行了釀酒酵母的篩選，目的是獲得一種或幾種適合山葡萄發(fā)酵的、發(fā)酵能力強且酒香濃郁的釀酒酵母。在發(fā)酵過程中，酵母CEC01起發(fā)最快，發(fā)酵速率快；酵母ADT起發(fā)較快，發(fā)酵速率最快；發(fā)酵完成后，酵母MST的發(fā)酵蒸餾酒酒精度最高，發(fā)酵最徹底，產酒能力優(yōu)于其他酵母（P＜0.05），其次是酵母CEC01；酵母CEC01發(fā)酵的山葡萄蒸餾酒中揮發(fā)性物質的含量最高，其次是酵母VF、ADT；主成分建模分析得分最高的是酵母CEC01，其次是酵母ADT、MST。結果表明，酵母CEC01、ADT發(fā)酵能力強，產酒率高，且蒸餾酒的酒香濃郁、品質較好，適合釀造山葡萄蒸餾酒。