頂空固相微萃取葡萄酒揮發性物質的條件優化

李媛媛，李德美*，張亞東，王 燕，王宗義

（1.北京農學院 食品科學與工程學院，北京 102206；2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

揮發性物質影響了葡萄酒的感官特性以及葡萄酒的品質特征。在過去的十幾年中，研究人員從葡萄酒中已經鑒定并量化了大約800多種[1-2]，包括醇類，酯類，脂肪酸，酮類，酚類等[3-4]。目前，在進行葡萄酒揮發性物質分析時，需要針對分析物不同的物理或化學性質進行分離和富集[5]，根據萃取原理可將前處理的方法分為三類，第一類是根據樣品和萃取溶劑的沸點不同，采用同時蒸餾萃取法[6]等；第二類是根據相似相容原理，采用液-液萃取法[7]等；第三類根據香味物質對固相萃取柱附能力不同，采用固相萃取法[8]等。其中頂空固相微萃取法（headspace-solidphase micro extraction，HS-SPME）是目前被廣泛應用于葡萄酒中揮發性物質分析研究的萃取方法之一，其具有簡單、快速、高效、經濟、無溶劑、檢出限較低等特點，適用于從葡萄酒中提取和濃縮揮發性和半揮發性物質[9]。

近年來，對葡萄酒揮發性物質的相關研究有大量文獻報道，這些研究主要集中在葡萄酒風味物質形成機理及影響因素[10-11]和不同萃取方法的萃取效果的對比研究等[12-13]，但是，關于優化提取條件的研究較少。

本研究選取兩款種植面積最廣的葡萄品種所釀造的葡萄酒：霞多麗干白葡萄酒和赤霞珠干紅葡萄酒，通過對頂空固相微萃取條件進行優化，并對優化后的方法進行驗證，建立葡萄酒揮發性物質測定的最佳分析條件，以期為今后葡萄酒研究工作提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2015年霞多麗干白葡萄酒：天瑜酒莊；2016年赤霞珠干紅葡萄酒：煙臺張裕葡萄酒股份有限公司；12%（V/V）乙醇模擬酒溶液；NaCl、無水乙醇：北京化工廠；內標物和三個標準品的詳細信息見表1。

表1 內標物和標準品名稱、來源、純度、定量和定性離子Table 1 Name,source,purity,quantitative and qualitative ions of internal standard and standard substances

1.2 儀器與設備

7890A/5975C型氣質聯用儀、DB-5MS毛細色譜柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）、HS-SPME手動進樣手柄：美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪予儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香氣成分分析

樣品前處理：將10 mL酒樣、不同添加量的NaCl、50 μL 2-辛醇內標物（質量濃度為400 mg/L）和磁力轉子放入20 mL頂空瓶中，在恒溫加熱磁力攪拌器中平衡10min，經過不同的萃取溫度和時間后在GC進樣口解吸5 min，解吸溫度260 ℃。

色譜條件：初始溫度50 ℃，保持2 min，以4.0 ℃/min升至160 ℃，再以6.0 ℃/min升至250 ℃保持5 min；載氣為氮氣（N2），流速1 mL/min，無分流進樣。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃；SCAN全掃描。

定性分析[14]：運用計算機自帶數據庫美國國家標準與技術研究院（nationalinstitute ofstandardsand technology，NIST）08.L進行檢索和分析，結合相關文獻[15-17]，確定化學成分。

定量分析：采用內標法-標準曲線法對標準品含量進行定量分析。

1.3.2 準確度檢測

標準曲線構建：將3個標準品分別配制成5個不同濃度梯度的模擬酒溶液，萃取后進行儀器分析得到線性方程（n=3）。回收率測定：向12%（V/V）乙醇模擬酒溶液中別加入一定量已知濃度的3種標準品溶液，根據檢出總值以及加標量計算回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）（n=3）。

1.3.3 單因素試驗

依據頂空固相微萃取技術的相關文獻報道[18-19]，選取NaCl添加量、萃取時間和萃取溫度為單因素試驗中的研究因素，以研究其對葡萄酒中揮發性物質檢測獲得總峰面積的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果和Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以揮發性物質總峰面積（Y）為響應值，進行3因素3水平響應面試驗，確定兩款不同的葡萄酒揮發性物質萃取的最佳條件，響應面試驗因素與水平見表2。

表2 萃取條件優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factor and levels of response surface experiments for extraction condition optimization

2 結果與分析

2.1 萃取條件單因素試驗分析

2.1.1 NaCl添加量與總峰面積的關系

按照方法1.3.1，加入1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g和3.5 g NaCl，添加量相應為0.15 g/mL、0.20 g/mL、0.25 g/mL、0.30 g/mL和0.35 g/mL。在40 ℃條件下萃取30 min，研究不同NaCl添加量與風味物質總峰面積的關系，以選取合適的NaCl添加量。結果見圖1。

圖1 NaCl添加量對總峰面積的影響Fig.1 Effect of NaCl content on total peak area

由圖1可知，在保持萃取時間和萃取溫度恒定的條件下，當NaCl添加量未超過0.25 g/mL時，檢測出赤霞珠葡萄酒揮發性物質總峰面積隨著樣品中NaCl添加量的增加而增大，但霞多麗干紅葡萄酒珠葡萄酒揮發性物質總峰面積隨著樣品中NaCl添加量的增加呈現先下降后增長的趨勢，當NaCl添加量超過0.25 g/mL時，總峰面積不再增加反而降低，這可能是由于樣酒中無機鹽達到飽和狀態，揮發性物質在葡萄酒中的溶解度不再受無機鹽濃度的影響，再加入無機鹽也不會提高檢測物質的揮發性，甚至可能造成抑制揮發作用，故總峰面積不增反減。因此，本試驗選定樣品中NaCl添加量為0.25 g/mL。

2.1.2 萃取時間與總峰面積的關系

萃取時間選擇25 min、30 min、35 min、40 min、45 min，研究不同萃取時間與風味物質總峰面積的關系，以選取合適的萃取時間。結果見圖2。

萃取時間是指頂空瓶中的樣品、頂部空間和涂層纖維三相之間從萃取開始至達到平衡所需要時間，攪拌樣品和加溫等方法均可縮短平衡時間。針對不同的萃取樣品，萃取時間大致為20～50 min，最常用的萃取時間為30 min[20]，平衡萃取效果，從而選取最佳萃取時間。

由圖2可知，在保持樣品中NaCl添加量與萃取溫度恒定的條件下，兩款樣品風味物質總峰面積變化的規律不同。霞多麗干白葡萄酒萃取時間在25～35 min范圍時，揮發性物質總峰面積呈現先下降后增長的趨勢；萃取時間在35～45 min范圍時，呈現下降趨勢；總體而言，在35 min左右時，峰值達到最大。赤霞珠干紅葡萄酒萃取時間在25～45 min范圍時，揮發性物質總峰面積呈現先上升后下降的趨勢，在萃取時間為35 min時，揮發性物質總峰面積達到最大值，與霞多麗干白葡萄酒相比，其揮發性物質總峰面積隨萃取時間變化而波動的趨勢相對平穩。本試驗選取35 min作為萃取時間，并進行下一步分析。

圖2 萃取時間對總峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction time on total peak area

2.1.3 萃取溫度與總峰面積的關系

按照方法1.3.1，加入2 gNaCl，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃及60 ℃條件下萃取30 min，研究不同萃取溫度與風味物質總峰面積的關系，以選取合適的萃取溫度，結果見圖3。

圖3 萃取溫度對總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total peak area

萃取溫度一般在20～60 ℃之間，不宜過高，以免改變葡萄酒基質的原始成分[21]。由圖3可知，在樣品中NaCl添加量與萃取時間固定時，兩樣品揮發性物質測定峰值隨萃取溫度而變化的規律不同。霞多麗干白葡萄酒萃取溫度在20～40 ℃范圍時，揮發性物質總峰面積呈現先下降后增長的趨勢；萃取溫度在40～60 ℃范圍時，揮發性物質總峰面積呈現下降趨勢；總體而言，萃取溫度40 ℃時，揮發性物質峰面積最大。赤霞珠干紅葡萄酒萃取溫度在20～40 ℃范圍時，揮發性物質總峰面積呈現先增加后下降的趨勢，萃取溫度40 ℃時，揮發性物質峰面積最大。隨著溫度升高，分子熱運動越快，揮發性物質在樣品和涂層纖維中的擴散系數越大，萃取效果越好，但是，溫度過高則會使得不易揮發的大分子物質吸附在萃取頭上，易揮發的小分子物質很難吸附在萃取頭上[22]，降低揮發性物質在涂層纖維上的分配系數。本試驗選取40 ℃作為萃取溫度。

2.2 響應面優化分析

2.2.1 建立模型

利用Design-Expert 8.0.5b設計響應面試驗，共設計了17個試驗點，12個析因試驗，5個中心點試驗，試驗設計及結果見表3。

表3 干白、干紅葡萄酒萃取條件優化響應面設計及結果Table 3 Design and results of response surface methodology for extraction conditions optimization of dry white and dry red wine

2.2.2 模型顯著性檢測

對該模型進行顯著性檢驗和方差分析，結果見表4、表5。并得到初步回歸方程如下：

由表4、表5可知，兩種擬合模型P值均＜0.01，說明模型差異極顯著，表明試驗方法可行；失擬項均不顯著（P1=0.206＞0.05；P2=0.158＞0.05），說明回歸方程擬合度較好，試驗誤差比較小。

由表4可知，回歸模型中B、A2、AB、AC對總峰面積的影響顯著（P＜0.05）；B2、C2、BC對揮發性物質總峰面積的影響極顯著（P＜0.01）。由表5可知，回歸模型中C對揮發性物質總峰面積的影響顯著（P＜0.05）；回歸模型中A、B、A2、B2、C2、BC對總峰面積的影響極顯著（P＜0.01）。從表4和表5所列的F值大小可知，本試驗設定的三個影響因素對兩個樣品中揮發性物質總峰面積影響程度依次為B＞A＞C。

表4 霞多麗干白葡萄酒回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of the regression equation of Chardonnay dry white wine

表5 赤霞珠干紅葡萄酒回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of the regression equation of Cabernet Sauvignon dry red wine

霞多麗干白葡萄酒和赤霞珠干紅葡萄酒揮發性物質萃取時，NaCl添加量、萃取時間、萃取溫度三個因素交互作用對樣品中揮發性物質測定總峰面積的響應面及等高線見圖4。由圖4可知，曲線走勢的坡度越陡，說明該因素對揮發性物質測定峰面積的影響越顯著；坡度越平滑，影響則越小，三種因素兩兩交互作用對樣品中揮發性物質測定總峰面積均有一定程度的影響。

圖4 各因素交互作用對總峰面積影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on total peak area

通過對回歸模型進行驗證，得到霞多麗干白葡萄酒揮發性物質最適萃取條件為NaCl添加量0.259 g/mL，萃取時間34.17 min，萃取溫度40.35 ℃；赤霞珠干紅葡萄酒揮發性物質萃取時最適條件為：NaCl添加量為0.256 g/mL，萃取時間為35.80 min，萃取溫度為39.81 ℃。在此條件下，預測總峰面積分別為1.958×1010和1.455×1010?？紤]到試驗可操作性，選擇NaCl添加量為0.25 g/mL、萃取時間35 min和萃取溫度40 ℃條件下，實際總峰面積分別為1.955×1010和1.427×1010。最適條件預測總峰面積與實際總峰面積相近，說明優化后的萃取條件具有可行性。

2.3 HS-SPME分析方法驗證

由表6可知，正己醇、正己酸乙酯和辛酸標準品在利用本試驗優化的最佳萃取條件下得到的保留時間相差較小，表明其穩定性良好，因此，該萃取條件結合色譜條件可以較為準確地對未知揮發性物質進行定性分析。

表6 標準品的保留時間、回歸方程、相關系數、回收率Table 6 Retention time,regression equation,correlation coefficient and recovery of standard

由表6可知，正己醇、正己酸乙酯和辛酸標準品的相關系數均在0.990以上，結果表明標準曲線的線性良好，該方法能很好地對未知揮發性物質進行定量分析。相對標準偏差（RSD）反映波動的相對大小，數據之間的波動性越大，RSD也越大，一般小于2%[23]?；厥章试?8.3%～100.53%范圍內，表明該方法準確度較高。標準品回收率試驗的RSD處于0.59%～0.91%范圍內，表明數據波動不大，具有良好的準確度和精密度。

3 結論

本試驗基于HS-SPME-GC-MS方法，對霞多麗干白葡萄酒和赤霞珠干紅葡萄酒揮發性物質的萃取條件進行了優化，并對優化后的萃取條件進行了驗證。對響應面優化法獲得的試驗數據分析，兩款樣品均在NaCl添加量為0.25 g/mL，萃取時間為35 min，萃取溫度為40 ℃的萃取條件下效果最佳。表明此方法具有一定的通用性。通過對優化的萃取條件進行定性和定量試驗驗證得出，該方法穩定性良好，準確度及精確度較高，結果表明該萃取條件試驗效果較好，具有可行性。