水蜜桃酒控制乙酸發酵工藝優化

朱勝男 ，曹嘉閩，葉 華，李松林，陳曉明*，季 方，張丹丹，袁小轉，胡佳佳，劉夢夏，張 旺，許光斗

（1.淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223001；2.江蘇今世緣酒業股份有限公司，江蘇 淮安 223001）

水蜜桃（Prunus persica）又稱長壽果，其汁多味美，富含人體所需的多種營養素，營養價值高[1]。但水蜜桃易腐爛變質，即使采用低溫保藏，也只能存放15 d左右，供應期短[2]。因此許多桃園都采用土法將水蜜桃發酵成酒，以減少損失。土法釀制后發現產品存在酒體偏酸，口感生硬不柔和的缺陷。經檢測土法釀制的水蜜桃酒中乙酸含量為1.415 g/L，而乙酸是揮發酸的主要成分，約占揮發酸的90%[3]。揮發酸是酒中的有害物質，酸味極強，影響酒的品質[4]。因此果酒中乙酸的含量直接影響揮發酸的含量。無病蟲害的水蜜桃中并不含乙酸，乙酸是在酵母發酵的過程中產生的。乙酸產生的主要原因是發酵液被醋酸菌所污染將乙醇轉化成了乙酸，或者是由于酵母的不正常發酵產生了不良代謝產物[5]。乙酸的含量越高，揮發酸含量就會越高，果酒的香氣越不明顯，酸澀味越強，協調性越差，生硬后苦感越強[6]。目前對桃酒的研究和報道多集中在釀造工藝[7]和澄清[8]等方面，少有對乙酸含量進行研究。

本研究擬對水蜜桃酒中乙酸進行研究和控制，基于單因素試驗，進行響應面試驗設計，通過響應面法優化發酵條件來抑制醋酸菌的生長或給予酵母優良的發酵環境來降低乙酸含量，進而降低水蜜桃酒中揮發酸的含量。同時對水蜜桃酒的品質指標進行檢測，為水蜜桃果酒進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水蜜桃：江蘇陶然生態農業科技有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、偏重亞硫酸鉀（分析純）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司；果膠酶（≥132 000 AVJP/g）：荷蘭帝斯曼有限公司；白砂糖（食品級）：柳州市柳冰食品廠；乙酸（分析純）、甲醇、磷酸、磷酸二氫鉀（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9030A恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；JA5003N分析天平：上海佑科儀器儀表有限公司；labostarTM TWF UV7純水儀：上海西門子水處理技術有限公司；1200安捷倫高效液相色譜儀：安捷倫科技（北京）有限公司；3K15高速冷凍離心機：德國Sigma實驗室離心機公司；PH計：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水蜜桃酒釀制工藝流程及操作要點

水蜜桃→分選清洗去核→切塊破碎→SO2護色→酶解→補糖→接種酵母菌→發酵→酒糟分離→后發酵→水蜜桃酒

操作要點：

水蜜桃預處理：選取成熟、個大飽滿的優良水蜜桃，清洗干凈后切塊去核，使用榨汁機破碎果肉得到水蜜桃漿汁。

護色：在水蜜桃漿汁中加入140 mg/L的偏重亞硫酸鉀使SO2的添加量為70 mg/L。

酶解：加入2mL/100L的帝斯曼果膠酶于50℃酶解1.5 h，酶解pH為4，酶解后不進行滅酶處理。

補糖：水蜜桃漿汁的糖度為60～100 g/L，為了達到試驗所需的酒精度，需要將漿汁的糖度補充至200 g/L。本試驗采用兩種補糖方式：一次加糖和二次加糖。一次加糖為一次性將起始糖量補充至200 g/L；二次加糖為先將水蜜桃漿汁的糖度補充至160 g/L，待發酵3 d后再補充40 g/L至200 g/L。

發酵：用10%的溫糖水對活性干酵母進行活化并按照總質量的0.2%接種，置于21 ℃無氧發酵15 d，待發酵液中的含糖量低于10 g/L時結束發酵。

酒糟分離：待發酵結束后，用無菌濾布將水蜜桃酒濾出。

后發酵：為了使水蜜桃酒風味成熟，促進酒體的澄清，將濾出的水蜜桃酒于15 ℃后發酵90 d，得水蜜桃酒。

1.3.2 發酵工藝優化單因素試驗

以乙酸含量為評價指標，分別考察不同起始糖量（160g/L、180 g/L、200 g/L、220 g/L、240 g/L）、不同加糖方式（一次加糖、二次加糖）、SO2的添加量（0、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、90 mg/L）以及發酵溫度（15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃）對乙酸含量的影響。

1.3.3 發酵工藝優化響應面試驗

通過單因素試驗，選擇3個主要影響因素起始糖量（A）、SO2添加量（B）、發酵溫度（C）為影響因素，以乙酸含量（Y）作為響應值，利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken進行3因素3水平的響應面設計，試驗水平分別用-1、0、1來表示，試驗設計水平編碼值見表1。

表1 響應面試驗設計優化發酵工藝因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design for optimization of fermentation technology

1.3.4 乙酸含量的檢測

乙酸含量檢測采用高效液相色譜法。

標準溶液的配制：分別配制0.312 5 g/L、0.625 0g/L、1.250 0 g/L、2.500 0 g/L、5.000 0 g/L的五個質量濃度梯度的乙酸標準溶液[9]。

樣品預處理：將水蜜桃的發酵液離心后，取上清液過0.25 μm微孔濾膜[10]。

色譜條件：Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進樣量10 μL；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；波長210 nm；流動相A甲醇；流動相B水相；流動相C磷酸緩沖液；采集時間40 min[11]。

定性定量分析：將乙酸單標和不同梯度的乙酸標品進樣，確定出峰時間，制作乙酸標準曲線。將水蜜桃酒樣品進樣，通過出峰時間進行乙酸定性，按照乙酸標準曲線回歸方程計算乙酸含量。

1.3.5 水蜜桃酒品質指標的檢測

總糖、總酸、酒精度的測定參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；pH的測定：使用pH計；異丁醇、異戊醇、雜醇油：氣相色譜法[12]；甲醇：參照GB 5009.266—2016《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》；黃酮：蘆丁當量法[13]；總酚：福林-酚法[14]。

2 結果與分析

2.1 乙酸標準曲線的繪制

圖1 乙酸標準品高效液相色譜圖Fig.1 Chromatography of acetic acid standard analysis by HPLC

圖2 乙酸標準曲線Fig.2 Standard curve of acetic acid

乙酸含量進行高效液相色譜分析，結果見圖1。以乙酸質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制乙酸標準曲線，結果見圖2。

由圖1可知，乙酸標準品的出峰時間為8.470 min，由圖2可知，乙酸標準曲線回歸方程為y=368.067x-4.8125，線性范圍為0.312 5～5.000 0 g/L，相關系數R2為1.000 0，檢出限為0.001 2 g/L。

2.2 發酵工藝優化單因素試驗

2.2.1 起始糖量的確定

圖3 不同起始糖量對乙酸含量的影響Fig.3 Effect of different initial sugar contents on acetic acid contents

由圖3可知，不同的起始糖量會導致乙酸含量的不同，隨著起始糖量的降低乙酸也會隨之降低，起始糖量為160 g/L、180 g/L、200 g/L、220 g/L、240 g/L時，發酵15 d時的乙酸含量分別為0.524 g/L、0.528 g/L、0.537 g/L、0.612 g/L、0.691 g/L。采用較低的起始糖量乙酸含量會明顯降低，這是因為較高的起始糖量導致酵母所處環境的滲透壓高[15]，會抑制酵母生長，從而不能進行正常的酒精發酵，導致乙酸較高，這與蔡錦林[16]研究的結果一致。結果表明，在一定范圍內降低起始糖量可以有效降低乙酸的含量，采用160 g/L、180 g/L、200 g/L的起始糖量產生的乙酸較為接近，同時考慮試驗需達到的酒精度，選用最適起始糖量為200 g/L。

2.2.2 加糖方式的確定

圖4 不同加糖方式對乙酸含量的影響Fig.4 Effect of different adding sugar methods on acetic acid contents

由圖4可知，二次加糖方式相比于一次加糖能夠有效控制乙酸的含量，乙酸隨發酵時間延長而上升的趨勢較平緩，乙酸含量從0.537 g/L降至0.501 g/L，比一次加糖下降了6.704%，這是因為一次加糖較二次加糖在同一時間段內產生的滲透壓高，所以二次加糖更利于酵母進行酒精發酵，減少不良發酵產物產生。因此，選用二次加糖方式。

2.2.3 SO2添加量的確定

SO2是發酵中常用的食品添加劑，其作用主要有抑菌、抗氧化、降低褐變程度、增酸、改善果酒風味等[17]。過量或不足都會影響酒的口感和品質，對乙酸也會產生一定影響。由圖5可知，當SO2添加量為0、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、90mg/L時，發酵15d時的乙酸含量分別為0.924g/L、0.741g/L、0.659 g/L、0.537 g/L、0.575 g/L。在一定范圍內乙酸含量隨SO2添加量的增加在逐漸降低，相比于不添加SO2的水蜜桃酒乙酸得到明顯抑制，SO2的添加可以抑制雜菌的生長，因此能有效控制乙酸的含量。但SO2也會增加果酒的酸度，同時過高的SO2含量不利于酵母的正常發酵，SO2的添加量過大時，乙酸的含量也會增加，從而當SO2為90 mg/L時，乙酸的含量較70 mg/L時有所上升，這與周濃[18]的研究結果一致。因此，選用最適SO2添加量為70 mg/L。

圖5 不同SO2添加量對乙酸含量的影響Fig.5 Effect of different SO2 addition on acetic acid contents

2.2.4 發酵溫度的確定

酵母菌體內的酶活受發酵溫度的影響，發酵溫度不適會導致不正常的酒精發酵，產生乙酸[19]。由圖6可知，發酵溫度為15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃時，發酵15天時的乙酸含量為0.623 g/L、0.583 g/L、0.537 g/L、0.652 g/L、0.764 g/L，在一定范圍內，隨著溫度的降低乙酸的含量也會降低，這是由于低溫會抑制醋酸菌的生長，減少乙酸的產生，因此當發酵溫度從27 ℃降至21 ℃時，乙酸含量從0.764 g/L降至0.537 g/L。當發酵溫度繼續降低至15 ℃時，乙酸含量有所增加，這是因為溫度過低時，酵母的生長也會受到抑制，發酵遲緩，起酵速度慢，產生不良的代謝產物。因此在一定溫度范圍內，采用低溫發酵能抑制其他雜菌的酶活，進而抑制其生長，能有效控制乙酸，這與張晶[20]的研究結果一致。因此，選用最適發酵溫度為21 ℃。

圖6 不同發酵溫度對乙酸含量的影響Fig.6 Effect of different fermentation temperature on acetic acid contents

2.3 發酵工藝優化響應面試驗結果及分析

在單因素試驗基礎上，選擇3個主要影響因素起始糖量（A）、SO2添加量（B）、發酵溫度（C）為影響因素，以乙酸含量（Y）作為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行設計，并按照設計進行響應面試驗，每組試驗設置3個平行，響應面試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 發酵工藝優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization

對表2的數據進行分析，得到擬合方程為：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知，模型中F值=181.97，P＜0.000 1，說明模型差異極顯著（P＜0.01）；失擬項P值=0.347 5＞0.05，說明失擬項不顯著，說明模型可用于預測。模型決定系數R2=0.9957，調整決定系數R2adj=0.9903，預測決定系數R2pred=0.9610，都＞0.9，并且R2adj與R2pred值相近，表明實驗值與預測值相近，相關性好，可以用來預測水蜜桃酒控制乙酸的工藝優化。

F值表示對乙酸的影響力大小，F值越大說明對乙酸的影響越大。從表3中得出FA=371.08，FB=29.33，FC=70.42，因此A、B、C3個因素的對乙酸的影響順序為A＞C＞B，即起始糖量＞發酵溫度＞SO2添加量，且A、B、C三個因素的都對乙酸的影響極顯著（P＜0.01）。

3個因素的交互響應面及等高線如圖7所示，AB、AC、BC交互影響等高線為圓形，表明交互影響不顯著，而A2、B2、C2對乙酸的影響極顯著（P＜0.01）。

根據響應面試驗得到發酵過程中控制乙酸的最佳發酵工藝為起始糖量179.80 g/L，SO2添加量72.12 mg/L，發酵溫度20.53 ℃，在此條件下乙酸含量預測值為0.498 g/L。為了便于實際操作，將最佳發酵工藝修正為起始糖量180 g/L，SO2添加量72 mg/L，發酵溫度21 ℃。在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，乙酸含量實際值為0.499 g/L，與預測值相近，證明模型有意義，采用最佳工藝能有效降低乙酸含量。

圖7 起始糖量、SO2添加量、發酵溫度交互作用對乙酸含量影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar contents,SO2 addition and fermentation temperature on acetic acid contents

2.4 水蜜桃酒品質指標的檢測

由表4可知，水蜜桃酒的各項指標均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求，且乙酸、雜醇油含量較低，黃酮、總酚含量分別為84.053 mg/L、87.302 mg/L，品質較高。該水蜜桃酒果香馥郁、醇香濃厚，酒體協調。

表4 水蜜桃酒品質指標檢測結果Table 4 Detection results of quality indexes of peach wine

3 結論

本試驗針對水蜜桃酒酒體酸澀的問題，通過響應面的方法對發酵工藝進行優化，有效降低了水蜜桃酒中乙酸的含量，得到了控制乙酸的最佳發酵工藝參數為：起始糖量180 g/L，SO2添加量72 mg/L，發酵溫度21 ℃。在此優化工藝條件下，乙酸含量為0.499 g/L，與土法釀制的水蜜桃酒相比，乙酸含量降低了64.73%，為今后水蜜桃酒中乙酸的控制與研究提供了理論依據。