鎖擲孢酵母產胞外多糖發酵條件優化

裴芳藝，薛 迪，馬巖石，劉宇超，劉得水，李 慧，劉 韓

（齊齊哈爾醫學院 科研處，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

酵母胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是酵母在生長代謝過程中產生并分泌到細胞外的長鏈、高分子聚合物[1-2]。相比酵母發酵生成的胞內多糖和胞壁多糖而言，合成的EPS更易與菌體分離，能通過深層發酵實現工業化生產，且具有生產周期短、不受季節氣候影響等優點[3]。酵母EPS可作為凝固劑、乳化劑和抗氧化劑等被廣泛應用于食品、化工、制藥等多種領域，具有較強的市場競爭力和廣闊的發展前景[4-5]。但目前的研究顯示，酵母EPS產量不高，不能達到大規模生產的要求，因此提高酵母EPS的產量是目前急需解決的問題[6-7]。

微生物發酵產EPS不僅受自身性質影響，而且發酵培養條件（如培養應溫度、培養時間、培養基初始pH值）也對微生物產EPS影響顯著[8]。微生物只有在特定環境下，生長到穩定期才開始逐漸積累EPS，同一種微生物在不同環境下可以產生不同種類和產量的EPS。因此，研究微生物產EPS的培養條件就顯得格外重要[9]。微生物產EPS的最佳溫度和pH值通常與其生長所需的最適溫度和pH值有所不同，為最大限度的提高EPS產量，需通過控制不同的理化參數[10]。隨著研究的不斷深入，多種產EPS的酵母菌被分離鑒定出來，如赭色擲孢酵母（Sporobolomyces salmonicolor）AL1[11]、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）GUMS16[12]、黃色隱球菌（Cryptococcus flavus）A51[13]、羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）AL100[14]、斯達油脂酵母（Lipomyces starkeyi）VITMN03[15]。并且通過對產糖條件的優化，大幅度提高EPS產量。其中近粉紅鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）屬于鎖擲孢酵母屬，作為一類非常規酵母，早期研究主要集中在分類學、環境治理和生物防治等方面[16-17]。但目前對S.pararoseus產EPS的研究相對較少，因此，篩選出新型能夠高產EPS的S.pararoseus是本研究重點。

本研究以近粉紅鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）PFY-Z1為供試菌株，通過測定其在4種產糖培養基中合成EPS的含量，篩選出一種最適發酵產糖培養基。并以此為基礎，通過單因素試驗、Plackett-Burman（PB）試驗和中心組和設計（central composite design，CCD）試驗，優化菌株產EPS的最佳發酵條件。為S.pararoseusPFY-Z1 EPS的分離純化以及工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

近粉紅鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）PFY-Z1：分離自齊齊哈爾地區葡萄園土壤。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸二氫鉀、氯化鈉、苯酚、硫酸、三氯乙酸（均為分析純）：天津市江天化工技術有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）瓊脂培養基、YPD液體培養基、WL營養瓊脂：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

產糖1號培養基：蔗糖60 g/L，蛋白胨2 g/L，硫酸銨1 g/L，硫酸鎂0.35 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，蒸餾水1 L，pH值6，115 ℃滅菌20 min[18]。

產糖2號培養基：葡萄糖15 g/L，硫酸銨15 g/L，硫酸鎂1.8 g/L，氯化鈣0.28 g/L，磷酸氫二鉀0.24 g/L，氯化鈉0.6 g/L，蒸餾水1 L，pH值7.0，121 ℃滅菌15 min[19]。

產糖3號培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，硫酸銨15 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，蒸餾水1 L，pH值6.6，121 ℃滅菌15 min[20]。

產糖4號培養基：葡萄糖50 g/L，硫酸銨2 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，酵母浸粉1 g/L，蒸餾水1 L，pH值6，115 ℃滅菌20 min[21]。

1.2 儀器與設備

5804R臺式高速大容量冷凍離心機、22331Hamburg高速離心機：德國艾本德公司；V-5000可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；FE28 pH計、AL204電子天平：梅特勒-托利多集團；HZQ-211C落地振蕩器、DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；CX31光學顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株生長特性

將活化后的菌株按2%（V/V）的接種量分別接種于4種產糖培養基中，28 ℃、140 r/min培養5 d，每隔12 h取樣，測定菌株在波長600 nm處的吸光度值和pH值，探究菌株的生成及pH值變化情況，設置三組平行樣。

1.3.2 胞外多糖的提取

多糖的提取參照DU R P等[22]的方法。將活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至產糖培養基，28 ℃140 r/min培養5 d。發酵液4 ℃、11 000 r/min離心20 min。上清液中加入3倍體積分數95%的乙醇，4 ℃靜置24 h后，4 ℃、11 000 r/min離心20 min，用適量去離子水溶解多糖沉淀，獲得粗EPS。

1.3.3 胞外多糖含量的測定

通過乙醇沉淀法獲得EPS，以葡萄糖為標準制作標準曲線[23]，利用苯酚-硫酸法[24]測定菌株在4種培養基中發酵產EPS的含量。取EPS溶液1 mL與1 mL 6%的苯酚溶液、5 mL濃硫酸混勻，靜置冷卻至室溫后，于波長490 nm處測定吸光度值。

1.3.4 單因素試驗優化產糖條件

將菌株接種于最適產糖培養基中，在不同培養條件下測定菌株產EPS的含量，確定其最佳發酵條件。

分別考察不同溫度（22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃）、轉速（0、70 r/min、140 r/min、210 r/min、280 r/min）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，V/V）、裝液量（50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、150 mL/250 mL、200 mL/250 mL）、培養時間（1 d、3 d、5 d、7 d、9 d）、初始pH值（2、3、4、5、6、7、8）對菌株產胞外多糖的影響。

1.3.5 PB試驗設計

EPC模式的最主要優勢在于建設單位只需要進行一次招標，只需與施工總承包方簽訂合同。因此，招標和合同管理的工作量將會大大減少，簡化了許多流程，同時責權分明。

根據單因素試驗結果，選擇影響EPS產量的6個因素（溫度、轉速、接種量、裝液量、培養時間、初始pH值）為評價因素，以EPS產量Y為響應值，將每個因素分為高（+1）、低（-1）2個水平。PB試驗設計因素與水平見表1，共進行15組試驗。

1.3.6 CCD試驗設計

根據PB試驗結果，以EPS產量（Y）為響應值，選擇對結果影響較大的因素培養溫度、培養時間、初始pH值，進行CCD試驗，得到最優方案。CCD試驗設計因素與水平見表2。

表2 中心組合試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.3.7 驗證試驗

將活化后的菌株接種于最適產糖培養基中，按優化后的發酵條件培養。通過乙醇沉淀法獲得EPS，利用苯酚-硫酸法測定EPS含量。

1.3.8 數據統計分析

響應面試驗設計使用Design Expert 8.0；統計分析和繪圖使用Excel 2016。

2 結果與分析

2.1 菌株生長特性分析及培養基的選擇

菌株S.pararoseusPFY-Z1在4種產糖培養基中的生長曲線及pH變化見圖1。

圖1 菌株PFY-Z1生長曲線和pH變化曲線Fig.1 Growth curve and pH variation curve of strain PFY-Z1

由圖1可知，菌株在產糖2號培養基中生長情況優于其余3種培養基，在發酵24 h時進入對數生長期，72 h時OD600nm值達最大，為1.123±0.006，之后進入穩定期，隨著菌株生長速度的增加，pH值下降速度增加，pH值由初始7.0降至2.74，說明菌株在發酵過程中產生酸性物質。4種產糖培養基中，菌株在產糖1號培養基中生長較差，最大OD600nm值為0.730±0.003，僅為產糖1號培養基的65%。可能是該培養基的碳源與其他3種培養基不同，這也說明以蔗糖為單一碳源進行S.pararoseusPFY-Z1發酵可能不利于菌株自身生長。這與菌株生理生化試驗相一致，即菌株對蔗糖的利用能力較弱。生長比較產糖2號培養基和3號培養基發現，菌株的生長的最大OD600nm值相差不大，但產糖3號培養基菌株生長進入對數期的時間較長，會延長培養時間。4種培養基發酵終止時pH值相差不大，在2.7～3.2范圍內，說明菌株在4種培養基內均發酵產酸。這與趙英杰等[25-27]的研究相一致。因此，綜合菌株生長狀況、發酵時長、成本節約等因素考慮，產糖2號培養基最適宜用作S.pararoseusPFY-Z1的培養。

2.2 最適產糖培養基的選擇

通過苯酚-硫酸法制作葡萄糖標準曲線，得到葡萄糖標準曲線方程為：y=9.855x+0.009，R2=0.999。菌株S.pararoseusPFY-Z1在不同培養基中EPS產量分別為（1.13±0.06）g/L（產糖1號培養基）、（3.31±0.06）g/L（產糖2號培養基）、（2.71±0.11）g/L（產糖3號培養基）、（0.60±0.09）g/L（產糖4號培養基）。其中菌株在產糖2號培養基產糖能力最強，與其生長特征相符合。不同酵母菌發酵產EPS，在碳源的選擇上有所不同。本研究選擇產糖2號培養基進行發酵產糖條件優化試驗。

2.3 單因素試驗優化菌株產EPS分析

2.3.1 培養溫度對EPS的影響

培養溫度對菌株S.pararoseusPFY-Z1的產EPS影響結果見圖2。由圖2可知，培養溫度在22～31 ℃時，菌株PFY-Z1上清液中EPS含量相差不大，在3.0 g/L左右，其中在培養溫度為28 ℃時，EPS含量最高，為（3.36±0.08）g/L。當培養溫度為34 ℃時，EPS含量明顯低于其他溫度，可能是高溫影響菌株的生長速度，影響合成EPS的酶活性，從而降低菌株合成EPS的含量。大量研究表明，酵母菌的最適產糖培養溫度為20～30 ℃[27]，本研究中菌株的最適培養溫度為28 ℃。

圖2 培養溫度對菌株PFY-Z1胞外多糖產量的影響Fig.2 Effect of culture temperature on exopolysaccharide production of strain PFY-Z1

2.3.2 搖床轉速對EPS的影響

搖床轉速對菌株PFY-Z1的影響見圖3。由圖3可知，搖床轉速可以影響發酵液中的溶氧量，當搖床轉速較低時，單位時間內培養液的溶氧量也隨之降低，降低菌體的生長速度和EPS生成速率，隨著搖床轉速的不斷增加，菌體生長速度和EPS合成速度增加，但搖床速度過大時，由于剪切力過大，不利于菌株生長，使菌體過早衰亡，從而降低EPS產量。當搖床轉速為210 r/min時，菌株PFY-Z1產EPS的含量最高，為（3.77±0.11）g/L。因此，選擇最佳搖床轉速為210 r/min。

圖3 轉速對菌株PFY-Z1胞外多糖產量的影響Fig.3 Effect of rotation speed on exopolysaccharide production of strain PFY-Z1

2.3.3 接種量對EPS的影響

接種量對菌株PFY-Z1產EPS含量的影響見圖4。由圖4可知，隨著接種量的增加，菌株產EPS的含量呈現先升高后降低的趨勢。接種量過低時，菌株生長到對數生長期所需時間較長。接種量過大，使得培養基內的營養物質過早消耗，不利于菌株積累合成EPS。當接種量為5%時，EPS含量最高為（4.10±0.08）g/L。因此，菌株的最適接種量為5%。

圖4 接種量對菌株PFY-Z1胞外多糖產量的影響Fig.4 Effects of inoculum on exopolysaccharide production of strain PFY-Z1

2.3.4 裝液量對EPS的影響

裝液量對菌株PFY-Z1產EPS含量的影響見圖5。

圖5 裝液量對菌株PFY-Z1胞外多糖產量的影響Fig.5 Effects of loading liquid volume on exopolysaccharide production of strain PFY-Z1

由圖5可知，裝液量較低對發酵液中EPS含量影響較大，這可能是由于營養物質較少導致的，大部分營養物質用于菌體生長，導致發酵后期營養物質不足，減小了EPS積累。當裝液量為100 mL/250 mL時，EPS含量相對較高，為（4.12±0.07）g/L。因此，選擇裝液量100 mL/250 mL進行后續試驗。

2.3.5 培養時間對EPS的影響

培養時間對菌株PFY-Z1產EPS含量的影響見圖6。由圖6可知，培養前3 d，菌株主要利用營養物質進行生長，產EPS的能力較低，培養5 d時，菌株生長進入穩定期，開始積累大量EPS，培養9 d時EPS產量最高，但培養5 d（4.14±0.09）g/L和培養9 d（4.17±0.10）g/L時EPS的產量變化不大，出于節約時間和成本的考慮，選擇培養時間5 d進行后續試驗。

圖6 培養時間對菌株PFY-Z1胞外多糖產量的影響Fig.6 Effects of culture time on exopolysaccharide production of strain PFY-Z1

2.3.6 初始pH值對EPS的影響

圖7 初始pH值對菌株PFY-Z1胞外多糖產量的影響Fig.7 Effects of initial pH value on exopolysaccharide production of strain PFY-Z1

菌株生長和分泌EPS都需要在最適的pH值條件下進行，pH值影響細胞膜功能、細胞形態和營養物質的代謝[28]，而影響EPS的合成。初始pH值對菌株產EPS影響見圖7。由圖7可知，當初始pH值為2、3、8時，菌株EPS的合成受阻積累，這說明過酸或過堿的環境不僅不利于菌體生長，也會降低菌體產EPS的產量。初始pH值為4～7時，EPS產量呈現先上升后保持平穩，當pH值為5時，EPS產量最高，為（4.53±0.09）g/L，說明菌株在偏酸性環境下有利于EPS的積累。PAVLOVA K等[29]通過8株產糖酵母發酵產EPS前后的pH值測定發現，發酵24 h后，pH值從最初的5.3降至1.7～2.0，直至發酵結束，一直維持在這個水平上，說明EPS的積累需要在較低的pH值水平上。因此，選擇初始pH值為5進行后續試驗。

2.4 PB試驗分析

在單因素試驗的基礎上，PB試驗設計及結果見表3，回歸分析結果見表4。

表3 PB試驗設計及結果Table 3 Design and results of PB experiments

表4 PB試驗回歸分析結果Table 4 Regression analysis results of PB experiments

由表4可知，模型F值為62.98，兩水平析因試驗模型項顯著（P=0.000 2＜0.01），表明該模型具有重要意義，決定系數R2=0.986 9，說明存在98.69%的試驗數據可用該模型解釋，調整R2adj=0.971 3，二者均接近1，信噪比=23.621（＞4），證明該模型可以很好的擬合試驗數據。各變量對EPS影響顯著程度依次為X5＞X1＞X6＞X4＞X3＞X2，即培養溫度、培養時間和初始pH對菌株產EPS影響顯著（P＜0.01）。根據PB試驗結果，得到模型擬合方程如下：Y=4.26-0.17X1+0.014X2+0.039X3-0.042X4+0.27X5+0.11X6。

2.5 CCD試驗分析

在PB試驗的基礎上，CCD試驗設計水平及響應值EPS含量見表5，回歸分析見表6。

表5 中心組合設計試驗設計及結果Table 5 Design and results of central composite design experiments

表6 中心組合設計試驗回歸分析結果Table 6 Results of the regression analysis of central composite design experiments

續表

由表6可知，該模型項差異極顯著（P＜0.000 1），決定系數R2=0.993 7，說明存在99.37%的試驗數據可用該模型解釋，調整決定系數R2adj=0.988 0，二者均接近1，信噪比=38.526（＞4），變異系數CV=0.85%，表明試驗結果所得模型能夠較好的擬合試驗數據。模型失擬項無顯著性差異（P=0.077 1＞0.05），說明所選模型擬合性較好，無其它顯著性影響因素。因此，可以判斷CCD試驗設計是可靠的，該模型可以較好的應用于S.pararoseusPFY-Z1合成EPS的理論預測。各變量（X1、X5、X6）、交互項（X5X6）和各變量二次項（X12、X52、X62）對菌株產EPS有極顯著影響（P＜0.01），交互項（X1X5、X1X6）對菌株產EPS無顯著影響（P＞0.05）。根據CCD試驗結果，得到模型擬合方程如下：EPS含量=4.54-0.032X1+0.15X5+0.085X6+0.010X1X5-0.002 5X1X6-0.11X5X6-0.26X12-0.15X52-0.18X62。模型方程中二次項系數均為負，可知該方程擬合的曲面開口朝下，方程有極大值。預測培養溫度、培養時間和初始pH值分別為27.84 ℃、5.91 d和5.10時，方程有極大值，EPS的預測產量為4.58 g/L。

2.6 響應面交互作用分析

各因素及交互作用對S.pararoseusPFY-Z1產EPS影響如圖8所示。變量間的相互作用關系可從等高線圖和曲面圖形狀看出，橢圓形表明變量間的相互作用有顯著影響，圓形則表明無顯著影響。由圖8可知，發酵時間和初始pH交互作用的等高線呈橢圓形，表明其交互作用顯著（P＜0.05）。

圖8 各因素交互作用對菌株PFY-Z1胞外多糖產量影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on exopolysaccharide production of strain PFY-Z1

2.7 驗證試驗

CCD試驗中預測最佳產EPS試驗條件為培養溫度、培養時間和初始pH值分別為27.84 ℃、5.91 d和5.10。根據實際條件，將其分別調整為28 ℃、6 d和5.10進行驗證試驗，在此條件下，S.pararoseusPFY-Z1的EPS含量實際值為（4.60±0.13）g/L，與預測值4.58 g/L無顯著差異（P＞0.05）。響應面法優化后，菌株PFY-Z1產EPS水平是優化前（3.31±0.06）g/L的1.40倍。

3 結論

本研究從4種酵母產糖培養基中選擇出一種最適培養基（葡萄糖15 g/L，硫酸銨15 g/L，硫酸鎂1.8 g/L，氯化鈣0.28 g/L，磷酸氫二鉀0.24 g/L，氯化鈉0.6 g/L）。在此培養基的基礎上，通過單因素試驗和響應面試驗優化，得到菌株最佳產糖發酵條件為培養溫度28 ℃、培養時間6 d和初始pH值5.10，此時EPS含量為（4.60±0.13）g/L，是優化前（3.31±0.06）g/L的1.40倍。本研究為今后利用S.pararoseusPFY-Z1產EPS奠定了基礎，同時也為S.pararoseus工業化制備和生產提供了理論依據。