模糊綜合評判結合響應面法優化蘋果酒發酵工藝

馮 濤，馬博文，莊海寧，孫 敏，徐志民，楊末堯

（1.上海應用技術大學 香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海市農業科學院 食用菌研究所/家食用菌工程技術研究中心，上海 201403；3.美國路易斯安那州立大學 營養與食品科學學院，路易斯安那 巴吞魯日70803）

我國是世界蘋果生產第一大國，蘋果酒是延長產業鏈，增加農副產品附加值的重要途徑[1]。蘋果酒是繼葡萄酒之后的第二大果酒，是用新鮮蘋果或濃縮蘋果汁為原料釀造的一種酒精飲料[2]。蘋果酒含有少量的乙醇，保留了蘋果原有的糖類、氨基酸和礦物質等，飲用蘋果酒可以調節人體新陳代謝、促進血液循環，軟化血管、預防心血管硬化等疾病的發生[3]。蘋果酒質量評判是企業進行產品評優、質量控制、產品分級、優化工藝的重要方法和手段，如何系統、綜合地評判蘋果酒質量，是蘋果酒產業發展中亟待解決的問題[4]。但目前國內外對于蘋果酒的質量評估還沒有具體參考的標準，往往評定一款蘋果酒好與不好主要是通過感官評分、酒精度以及某種特征香氣物質質量濃度等單一指標作為評價優化的參考值，利用傳統的感官品評，想要克服人的主觀隨意性也是客觀了解真實品質的一個阻礙[5]，這些均不能全面客觀地反映酒的真實品質。

模糊綜合評判是對多種屬性的單個事物，或者說其總體優劣受多種因素影響的事物，作出一個能合理的綜合這些屬性或因素的總體評判[6]。應用“隸屬函數”來描述蘋果酒風味差異的中間過渡，為準確的描述和客觀評價蘋果酒的品質提供了數學方法[7]。該研究采用模糊綜合評價結合響應面設計試驗對蘋果酒發酵工藝進行優化[8-10]，隨之對發酵成品的香氣成分進行檢測分析，較為全面的描述了蘋果酒的品質特性，以期獲得更加客觀、貼近實際要求的優化工藝參數和工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌株（葡萄酒·果酒專用酵母）：是選自山東省煙臺帝伯仕酵母有限公司；蘋果（品種為紅富士）：市售。

果膠酶（CE 3.2.1.89，＞90 000 mSU/g）、發酵助劑、焦亞硫酸鉀、皂土：煙臺帝伯仕商貿有限公司；殼聚糖（食品級）：江蘇百味科技有限公司；纖維素酶（EC 3.2.1.15，＞22 500 U/g）：上海梯希愛化成工業發展有限公司；L-半胱氨酸（食品級）：廣州豪翔精細化工有限公司；抗壞血酸（食品級）：鄭州裕和食品添加劑有限公司。其他試劑均為分析純，購于上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

VK-8002加熱破壁機：德州市歐諾華生活電器有限公司；EMS-20S磁力攪拌水浴鍋：常州市人和儀器廠；16-7383高壓滅菌鍋：上海宜川上嶺儀表有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱：上海博訊實業有限公司；WYT-4型手持糖度計：泉州中友光學儀器有限公司；LAL2T酒精濃度計：廣州市速為電子科技有限公司；6890-5973型氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

蘋果→清洗、切塊→護色→榨汁→酶解分離→調糖、酸→滅菌→接種酵母→前發酵→倒罐→抽濾→后發酵→陳釀→過濾→終止發酵→蘋果酒

操作要點：將紅富士蘋果用水清凈晾干，去除果核，將蘋果切成3～5 cm的蘋果塊。配制復合護色液（抗壞血酸添加量為0.20%、L-半胱氨酸添加量為0.07%，焦亞硫酸鉀的添加量為0.1g/L），將蘋果塊浸泡于護色液中15 min，撈出晾干，于破碎機中榨汁[11]。分別添加60 mg/L的纖維素酶和果膠酶到蘋果果漿中，恒溫水浴55 ℃酶解1 h，靜置澄清。四層紗布過濾后，用低溫冷凍離心機5 000 r/min離心5 min，將分離得到的蘋果清汁巴氏殺菌，冷卻后加入蔗糖，調整總糖含量為18～20°Bx。在此基礎上添加檸檬酸調整總酸含量。

蘋果汁放入22 ℃的生化培養箱發酵7 d，第2天時加入已活化的帝伯仕發酵助劑（0.06～0.09 g/L）。發酵前期定時倒罐，攪拌5～15 min，發酵中期密閉發酵罐，發酵后期，當蘋果酒的酒精度在3%vol左右，降溫至0 ℃，終止發酵。添加0.06～0.1g/L的帝伯仕皂土和殼聚糖到蘋果酒中下膠澄清，靜置澄清3～5 d后，過濾分離。4 ℃冷藏3 d后，過濾，灌裝，即得成品。

1.3.2 理化指標測定

酒精度：按照GB/T 15038—2005《葡萄酒果酒通用分析方法》，采用酒精計法測定；總糖：使用手持測糖儀；總酸：采用電位滴定法測定[12]。

1.3.3 蘋果酒品質的模糊綜合評判

感官評定采用百分制法，由20名經過培訓的具有一定感官評定經驗的評定員，按國標和參考前人結果[3，5]修正后蘋果酒感官評分標準（見表1）的要求，對各個酒樣從色澤（滿分20分）、香氣（滿分40分）、滋味（滿分30分）、風格（滿分10分）4個方面進行感官評定，以很好、較好、一般、較差和差為評語集，建立單因素矩陣，構建主因素突出型綜合評判模型，采用M評判模型進行分析[13-16]。

表1 蘋果酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of cider

1.3.4 響應面試驗設計

本試驗在預試驗結果和參考文獻[3-6，17-19]的基礎上，選取影響蘋果酒品質的三個關鍵因子：初始pH值（A）、接種量（B）、初始糖度（C）作為試驗考察對象，以蘋果酒的模糊綜合評判總分（Y）為因變量即響應值，采用Box-Behnken試驗設計，因素水平見表2。

表2 蘋果酒發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests

1.3.5 香氣成分分析測定方法

香氣富集方法：頂空固相微萃取法，取15 mL的頂空瓶，用無菌移液管加入10 mL待分析的蘋果酒樣和2.0 g NaCl，再加入0.3 mL 2-辛醇（質量濃度為4.00 mg/L）作內標，50 ℃平衡20 min，然后將經色譜進樣口解吸30 min后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國Supelci.Co.）置入頂空瓶的上部頂空中，50 ℃吸附30 min。

香氣測定儀器參數：色譜柱為DB-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm）柱；進樣口溫度200 ℃；柱溫：初始溫度50 ℃，保持0 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持2.5 min，以8 ℃/min升至220 ℃后，保留5 min。質譜條件：采用電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，載氣為N2，流量為1.8 mL/min，進樣方式為分流進樣，分流比為50∶1，保持3 min。

定性方法：氣相色譜-質譜聯用儀得出分析總離子流圖，采用美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NIST）08質譜庫和Wiley譜庫用計算機進行檢索與匹配，并結合參考資料，確認香氣成分物質名稱。依照正構烷烴（C7～C30）在相同時間下的保留時間，按照KOVATS保留指數公式計算揮發性物質的保留指數（retention index，RI），得到的RI值與Wiley7n.1數據庫進行匹配，定性得到有效揮發性物質。

2 結果與分析

2.1 模糊數學模型的建立

2.1.1 建立評判集

依據表1對蘋果酒品質的要求進行模糊綜合評判，構建主因素突出型綜合評價模型。

對象集U=｛u1，…，ui，…，un｝=｛1#，2#，…，16#，17#｝

因素集X=｛x1，…，xj，…，xn｝=｛色澤，香氣，滋味，風格｝

評語集Y=｛y1，…，yp，…，ym｝=｛很好，較好，一般，較差，差｝

權重集W=｛w1，…，wi，…，wn｝=（0.20 0.30 0.40 0.10），其中

2.1.2 建立單因素評價矩陣

評判小組對每一因素進行逐個評判，對每個因素的每個評語的人次進行歸一化處理，即A=[a1*，…，ai*，…，a5*]，其中

分別統計每一因素xi對應的模糊評價Rij=（ri1，ri2，…，rin）∈f（Y），可以得到每個蘋果酒樣品的因素模糊綜合評價矩陣，得到酒樣的感官評定結果見表3。

表3 不同蘋果酒的感官評定結果Table 3 Sensory evaluation results of different ciders

2.1.3 線性轉換

以1#酒樣為例，可建立色澤、香氣、滋味和風格等4個單因素的模糊評價矩陣：

由上述結果得到1#酒樣的評判關系矩陣：

經過模糊線性轉換[20-21]，得到模糊綜合評判矩陣：

B=W×R=（b1，…，bj，…，b5）其中，模糊算子為M（·，⊕），即bj=

經計算得：B1=（0.395 0.35 0.205 0.03 0.02）

2.1.4 模糊綜合評判總分

設定感官特殊性[17]：很好為100分，較好為80分，一般為60分，較差為40分，差為0分，可建立感官特殊性數集V=（100 80 60 40 0），則樣品的模糊綜合評判總分為：T=B×V。得到1#蘋果酒樣品的總分為：

T1=（0.395 0.35 0.205 0.03 0.02）×（100 80 60 40 0）=81

同理可得到2#～17#酒樣的模糊綜合評判總分，見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Design and results of Box-Behnken tests

2.2 響應面優化試驗結果

通過Design Expert 7.0軟件對試驗進行回歸分析，預測蘋果酒發酵的最優工藝參數，方差分析結果見表5。對表4中的試驗數據進行多元回歸擬合后，得到的各因素與蘋果酒感官評分（Y）影響的二次多項回歸模型：

從回歸模型方差中可以看出，模型的一次項B以及二次項B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01）；一次項A、C和二次項A2對結果影響顯著（P＜0.05）；表明試驗設計中選取的影響因素對結果影響顯著，試驗因素變化與因變量結果之間的影響關系真實可靠。交互項均P＞0.05，說明因素之間無交互影響，對蘋果酒發酵的影響并不顯著，應用該模型時可以不用考慮各因素之間的交互作用。

表5 響應面試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface methodology

由方差分析（表5）可以看出，模型的Fmodel=17.73＞F0.01（9，5）=10.16，P=0.000 5＜0.01，表明酵母接種量、初始糖度和初始pH值對蘋果酒感官評分的影響顯著；失擬項P=0.3649＞0.05，不顯著，說明方程不失擬，可以用該模型分析和預測蘋果酒發酵的最佳條件；蘋果酒發酵模型決定系數R2=0.958 0，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，說明該模型是合適的；模型的調整決定系數R2Adj=0.903 9，說明該模型能解釋約90.39%響應值的變化，擬合程度較好。

離散系數（coefficient of variation，CV）反映了單位均值上的離散程度，表示實驗的精確度，本試驗CV=2.19%，說明實驗操作準確可信，可以用回歸方程模型對蘋果酒發酵工藝進行預測和分析。

試驗采用響應面法優化蘋果酒發酵條件，利用Design Expert 8.05b軟件，由二元回歸模型繪制響應面分析圖，響應值對各因素A、B、C的分析見圖1，直觀的反映各因素對響應值的影響。

通過軟件分析可以確定最佳發酵工藝參數：酵母菌接種量為9.69%，初始pH值為3.46，初始糖度為19.25 g/100 mL，感官評分預測值為89.266分。為實際操作所需，修正發酵工藝參數為酵母菌接種量10%，初始pH值3.5，初始糖度19 g/100 mL，經測定，此發酵條件下的蘋果酒酒精度為3.7%vol，總糖含量（以葡萄糖計）為16.42 g/100 mL，總酸含量（以酒石酸計）為7.9 g/L，感官評分為90分。

圖1 初始pH值、酵母接種量和初始糖度交互作用對蘋果酒感官評分的響應面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,inoculum and initial sugar content on sensory quality of cider

2.3 蘋果酒香氣成分測定

為全面驗證最佳釀造工藝下的蘋果酒品質的優劣，本試驗采用頂空固相微萃取/氣質聯用法及氣味活度值（odor activity value，OAV）法測定蘋果酒的風味物質成分和關鍵香氣成分，結果見表6。

表6 蘋果酒主要香氣成分的定量分析結果Table 6 Quantitative analysis results of the main aroma components in cider

續表

由表6可知，蘋果酒中共鑒定出33種香氣成分，主要包括16種酯類（占所有香氣物質種類總數的48.48%），9種醇類（27.27%）、4種酸類（12.12%），4種醛酮類（12.12%），與文獻結果[22-24]相似。各類物質的質量濃度從高到低分別是醇類物質564.983 mg/L，酯類物質42.285 mg/L，酸類物質8.983 mg/L，醛酮類物質2.359 mg/L。

用OAV法從蘋果酒香氣中鑒定出10種關鍵香氣組分：乙酸乙酯（4.93）、己酸乙酯（3.64）、辛酸乙酯（18.60）、戊酸乙酯（25.75）、癸酸乙酯（1.88）、肉豆蔻酸乙酯（14.00）、丁醇（137.96）、異戊醇（8.45）、苯乙醇（1.41）、辛酸（3.24）。這些物質的OAV均大于1，對蘋果酒的整體風味有貢獻。

3 結論

通過模糊綜合評判結合響應面法對蘋果酒發酵工藝條件進行優化，構建蘋果酒感官品評的主因素突出型綜合評判模型，得到最優發酵條件為：酵母菌接種量10%，初始pH值3.5，初始糖度19 g/100 mL，此發酵條件下的蘋果酒酒精度為3.7%vol，總糖含量（以葡萄糖計）為16.42 g/100 mL，總酸含量（以酒石酸計）為7.9 g/L，感官評分為90分，與感官預測值相差不大，提高了傳統感官評價的準確度、科學性和客觀性。利用頂空固相微萃取/氣質聯用法和OAV法測定蘋果酒的風味物質成分和關鍵香氣組分，鑒定了蘋果酒的10種風味突出貢獻成分為辛酸乙酯、戊酸乙酯、丁醇等物質，為蘋果酒香氣的控制提供了理論支持。