兩階段調控葡萄糖質量濃度強化赤蘚糖醇發酵的研究

劉金龍，孫錫友，趙國群*，王 勇，白 敬，孫 旭

（1.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050000；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050000）

赤蘚糖醇是一種天然的四碳多元醇，化學名是1,2,3,4-丁四醇，分子式為C4H10O4，作為低熱量功能性甜味劑已經使用了幾十年[1-2]，廣泛應用于食品、化妝品、醫藥及飼料行業。據2017年國際糖尿病聯盟發布的全球糖尿病地圖（第8版）顯示，全球約4.25億人罹患糖尿病，這一數據還在急速增長，而赤蘚糖醇誘導胰島素水平變化非常有限，是糖尿病患者理想的甜味劑[3-4]。

微生物發酵是赤蘚糖醇當前主要生產方法[5-6]。利用特定菌種如出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulsns）、木蘭假絲酵母（Candida magnoliae）、圓酵母（Torulasp.），Pseudozyma tsukubaensis，變異三角酵母（Trigonopsis variabilis），毛孢子菌屬（Trichosporonsp.）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等可高效合成赤蘚糖醇[7-12]。

赤蘚糖醇、甘露醇、甘油等在微生物細胞內通常充當平衡細胞內外滲透壓的抗滲物質。在利用耐高滲酵母發酵合成赤蘚糖醇過程中，赤蘚糖醇作為細胞對抗滲透壓的物質而產生，基于此生理特性，可以通過提供滲透壓脅迫來促進赤蘚糖醇的合成[13-15]。ANDREISHCHEVA E N等[16]通過添加NaCl來改變發酵體系中的滲透壓，從而提高了赤蘚糖醇產量。楊利博等[17]將甘油作為碳源用于赤蘚糖醇發酵，結果發現，高濃度甘油產生的滲透壓脅迫可以提高赤蘚糖醇的產量。高濃度的葡萄糖也可通過碳源供給和滲透壓脅迫雙重作用于解脂耶氏酵母合成赤蘚糖醇的過程[18-19]，基于此原理，該研究通過發酵動力學方面分析，優化葡萄糖的添加策略，為提高赤蘚糖醇的發酵效率，降低工業生產成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）JZ-204：河北省發酵工程技術研究中心保藏菌種。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；玉米漿干粉（生化試劑）：天津市利發隆化工科技有限公司；一水合葡萄糖（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；尿素（分析純）：天津歐博凱化工有限公司；甘露醇（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；赤蘚糖醇（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

搖瓶一級種子培養基：葡萄糖100 g/L，酵母膏10 g/L，尿素1 g/L，pH自然。

搖瓶二級種子培養基：葡萄糖100 g/L，酵母膏10 g/L，尿素1 g/L，pH自然。

發酵培養基：玉米漿粉15.0 g/L，酵母膏3.0 g/L，尿素0.1 g/L，pH自然，葡萄糖質量濃度根據需求添加。

培養基滅菌條件：使用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

5L發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；UV-6000PC型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SK-200B恒溫培養振蕩器：上海蘇坤實業有限公司；MJ-54A高壓滅菌鍋：施都凱儀器設備（上海）有限公司；LG16-A高速離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；S-10生物傳感器分析儀：深圳市希爾曼科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養方法

一級種子培養：從斜面試管取一菌環接種于搖瓶中，裝液量100 mL/500 mL，搖床轉速200 r/min，30 ℃培養24 h。

二級種子培養：從培養好的一級種子搖瓶中，按10%接種量接種于二級種子搖瓶，裝液量100 mL/500 mL，搖床轉速200 r/min，30 ℃培養24 h。

發酵培養：發酵罐裝液量3.5 L/5 L，轉速500 r/min，30 ℃，通氣量為3.5 L/min，初始pH自然。從培養好的二級種子搖瓶中，按10%接種量接種于發酵罐，培養至葡萄糖耗盡或216 h發酵結束。

1.3.2 菌體濃度測定

取1 mL發酵液稀釋適當倍數后，用分光光度計測定其在波長600 nm條件下的吸光度值（OD600nm值）。細胞干質量（dry cell weight，DCW）測定：取不同時間的1 mL發酵液，10 000×g離心10 min，去離子水洗滌2次，將待測樣品于80 ℃干燥至質量恒定，測其干質量。建立OD600nm值與細胞干質量方程（1）如下：

式中：OD600nm值控制在0.2～0.8，A為稀釋倍數。

1.3.3 赤蘚糖醇、甘露醇含量測定

取5.0 mL發酵液，8 000×g離心10 min，取上清液用超純水稀釋適當倍數，過0.22 μm有機濾膜，濾液使用高效液相色譜法測定赤蘚糖醇、甘露醇含量。

色譜條件：色譜柱為AminexHPX-87H糖分析柱（300mm×7.8mm），柱溫35℃，流動相為5mmol/LH2SO4，流速0.6mL/min，進樣量10 μL，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度30 ℃。

1.3.4 葡萄糖質量濃度測定

取0.5mL發酵液稀釋適當倍數，使葡萄糖質量濃度在0～4g/L范圍內，使用S-10生物傳感器分析儀檢測葡萄糖質量濃度。

生產強度是指單位時間內單位罐體積發酵液的產物積累量。赤蘚糖醇發酵生產強度根據公式（2）計算：

式中：赤蘚糖醇發酵生產強度，g/（L·h），赤蘚糖醇產物質量濃度，g/L，發酵時間單位為h。

1.3.5 數據處理

每組試驗重復3次，取平均值。采用Microsoft Excel 2013軟件對實驗數據進行處理，用Origin 2017繪圖軟件對實驗數據作圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖初始質量濃度對赤蘚糖醇發酵的影響

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種耐高滲酵母，可以通過產生赤蘚糖醇、甘露醇、甘油或阿拉伯糖醇來維持細胞內外的滲透壓平衡，使細胞正常生長[20-22]。葡萄糖作為碳源時，可以為發酵體系中的細胞提供滲透壓，從而促使解脂耶氏酵母菌過量合成赤蘚糖醇、甘露醇、甘油或阿拉伯糖醇等來維持細胞內外的滲透壓平衡[1，6]。

2.1.1 葡萄糖消耗過程曲線

在轉速（500 r/min）和培養溫度（30 ℃）的條件下，研究不同的初始葡萄糖質量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400g/L）對赤蘚糖醇發酵過程的影響。不同初始葡萄糖質量濃度條件下赤蘚糖醇發酵的葡萄糖消耗過程曲線見圖1，不同初始葡萄糖質量濃度對菌體生長的影響見圖2。

由圖1可知，100 g/L、200 g/L、300 g/L初始葡萄糖質量濃度分別于52 h、144 h、216 h消耗殆盡，而400 g/L初始葡萄糖質量濃度在216 h時還有143 g/L的殘糖。故高初始葡萄糖濃度（300 g/L和400 g/L）會延長發酵周期。

圖1 發酵過程中葡萄糖質量濃度變化曲線Fig.1 Change curves of glucose mass concentration during the fermentation process

2.1.2 不同初始葡萄糖質量濃度對菌體干質量的影響

如圖2所示，四種不同初始葡萄糖質量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）對菌體生長影響顯著，菌體濃度同初始葡萄糖質量濃度呈負相關。當初始葡萄糖質量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L時，菌體濃度分別在62 h、144 h、216 h、216 h達到了各自最高值34.7 g/L、38.2 g/L、34.5g/L、30.2g/L。結果表明，100 g/L初始葡萄糖質量濃度有利于解脂耶氏酵母的菌體生長，而高初始葡萄糖質量濃度（300 g/L和400 g/L）則會抑制解脂耶氏酵母的菌體生長。

圖2 不同初始葡萄糖質量濃度對菌體生長的影響Fig.2 Effect of different initial glucose mass concentration on cell growth

2.1.3 不同初始葡萄糖質量濃度對赤蘚糖醇的影響

不同初葡萄糖質量濃度對赤蘚糖醇產量的影響見圖3。如圖3所示，四種不同初始葡萄糖質量濃度（100 g/L、200 g/L、300g/L和400 g/L）條件下，赤蘚糖醇產量與初始葡萄糖質量濃度呈正相關，最高產量分別為6.40 g/L、50.21 g/L、80.76 g/L和86.08 g/L。結果表明，低初始葡萄糖質量濃度100 g/L不利于解脂耶氏酵母的合成赤蘚糖醇，而高初始葡萄糖質量濃度（300 g/L和400 g/L）則有利于解脂耶氏酵母的菌體生長。

綜上所述，初始葡萄糖質量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L時，300 g/L和400 g/L的高初始葡萄糖質量濃度有利于赤蘚糖醇合成，不利于菌體生長，反之，低初始葡萄糖質量濃度有利于菌體生長，不利于赤蘚糖醇合成。

圖3 不同初始葡萄糖質量濃度對赤蘚糖醇產量的影響Fig.3 Effect of different initial glucose mass concentration on erythritol production

2.1.4 初始葡萄糖質量濃度對副產物甘露醇的影響

在利用解脂耶氏酵母發酵生產赤蘚糖醇過程中，還檢測到大量甘露醇存在。甘露醇作為公認的細胞耐滲透物質，它的存在進一步印證了滲透壓脅迫有利于抗滲透產物的合成。初始葡萄糖質量濃度對副產物甘露醇的影響見圖4。

圖4 不同初始葡萄糖質量濃度對甘露醇的影響Fig.4 Effect of different initial glucose mass concentration on mannitol production

如圖4所示，副產物甘露醇在不同初始葡萄糖質量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）條件下，最高產量分別為9.87 g/L、14.48 g/L、15.92 g/L和16.44 g/L。結果表明，甘露醇最終濃度同初始葡萄糖質量濃度呈正相關。這一變化趨勢與TOMASZEWSKA L等[23]研究表明，甘油對解脂耶氏酵母菌發酵產赤蘚糖醇和甘露醇的影響結果一致。

2.2 不同葡萄糖質量濃度下解脂耶氏酵母發酵動力學分析

為了進一步分析葡萄糖質量濃度對菌體生長和赤蘚糖醇合成的影響，對4種不同初始葡萄糖質量濃度下的發酵參數進行了動力學分析，結果見圖5。

不同初始葡萄糖質量濃度對菌體比生長速率μ的影響結果見圖5A。由圖5A可知，在整個赤蘚糖醇發酵階段，不同初始葡萄糖質量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）條件下μ變化趨勢相差很大，其最大值分別為2.61 h-1、1.26 h-1、0.93 h-1和0.40 h-1。通過圖5A的菌體比生長速率曲線比較可知，初始葡萄糖質量濃度為100 g/L時最利于菌體生長。

不同初始葡萄糖質量濃度對赤蘚糖醇比合成速率的影響結果見圖5B。由圖5B可知，不同初始葡萄糖質量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L）下赤蘚糖醇比合成速率與初始葡萄糖質量濃度呈正相關，其最大比合成速率分別為0.014 h-1、0.039 h-1、0.075 h-1和0.082 h-1，由此可見，高濃度的葡萄糖更有利于赤蘚糖醇的合成。這與RYU Y W等[24]研究利用Candida magnolia菌生產赤蘚糖醇時，細胞生長和產物合成的最佳條件不同的結論相一致。

圖5 不同初始葡萄糖質量濃度條件下赤蘚糖醇發酵過程動力學參數的變化Fig.5 Change of kinetics parameters of erythritol fermentation under different initial glucose mass concentration

綜上所述，通過對赤蘚糖醇發酵過程中的菌體比生長速率（μ）和赤蘚糖醇比合成速率（qp）的分析，進一步驗證了300 g/L和400 g/L高初始葡萄糖質量濃度有利于赤蘚糖醇合成，不利于菌體生長，反之，低初始葡萄糖質量濃度有利于菌體生長，不利于赤蘚糖醇合成。

2.3 分階段葡萄糖質量濃度控制策略

通過對各初始葡萄糖質量濃度下的μ和qp進行分析發現，μ最大值隨著初始葡萄糖質量濃度的升高而降低，在初始葡萄糖質量濃度為100 g/L時，菌體可以快速生長，在22 h后開始變緩；而qp則是隨著初始葡萄糖質量濃度的升高而提高。考慮到初始葡萄糖質量濃度為400 g/L時，發酵到216 h時還有143 g/L的殘糖，發酵時間過長，且初始葡萄糖質量濃度300 g/L與400 g/L的赤蘚糖醇產量接近，故將發酵過程分為2個階段，分別為0～22 h（第1階段，發酵初始葡萄糖質量濃度為100 g/L）和22 h以后（第2階段，使用補料培養基，補加葡萄糖，使總耗糖量與初始300 g/L發酵時總耗糖量一致），各階段的發酵過程參數見圖6和表1。

圖6 采用分階段控制葡萄糖質量濃度的發酵過程曲線Fig.6 Fermentation curves of two-staged glucose concentration control strategy

表1 不同初始葡萄糖質量濃度下赤蘚糖醇分批發酵過程參數比較Table 1 Comparison of fermentation parameters among batches at different glucose concentration

如圖6所示，采用分階段控制葡萄糖質量濃度的策略，在前22 h，菌體可以快速生長，縮短延滯期，在補加葡萄糖后，由于高濃度葡萄糖的抑制作用，菌體生長變緩。但從圖中赤蘚糖醇產量變化曲線中可以看出，在補加葡萄糖后，赤蘚糖醇產量增加明顯。通過對不同葡萄糖質量濃度下赤蘚糖醇分批發酵過程參數比較（表1）表明，采用這一葡萄糖質量濃度兩階段控制策略，赤蘚糖醇最終產量為92.66 g/L，與初始葡萄糖質量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L的培養相比，分別提高了1 347.81%、84.54%、14.66%、7.57%；生產強度達到最高的0.48 g/（L·h），與初始葡萄糖質量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L的培養相比，分別提高了300%、37.14%、29.73%、20.00%。采用分階段控制葡萄糖質量濃度的策略，有利于縮短菌體生長延滯期和促進赤蘚糖醇的合成，為赤蘚糖醇的高效發酵合成提供參考。

3 結論

在發酵過程中，葡萄糖除作為碳源用于菌體生長代謝以外，還可以為發酵體系提供不同的滲透壓，從而促使耐高滲酵母利用其過量合成赤蘚糖醇、甘露醇等物質來維持細胞內外的滲透壓平衡，使細胞正常生長。因此，在赤蘚糖醇發酵過程中，葡萄糖質量濃度的控制對赤蘚糖醇的產量影響非常大。

本研究在5 L發酵罐水平上研究了葡萄糖質量濃度對解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）JZ-204發酵赤蘚糖醇的影響，發現較低的初始發酵葡萄糖質量濃度（100 g/L）有利于細胞的生長，縮短延遲期，使菌體快速增加；而較高的葡萄糖質量濃度（200～400 g/L）則有利于赤蘚糖醇的合成。基于對發酵參數的動力學分析，提出解脂耶氏酵母分批發酵生產赤蘚糖醇的兩階段葡萄糖質量濃度控制策略，即0 h時發酵初始葡萄糖質量濃度為100 g/L，22 h后通過補加葡萄糖，使總糖量與初始300 g/L發酵時總糖量一致。采用這一葡萄糖質量濃度兩階段控制策略，與初始葡萄糖質量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L和400 g/L的培養相比，赤蘚糖醇產量提高了1347.81%、84.54%、14.66%、7.57%；生產強度提高了300%、37.14%、29.73%、20.00%。