大蒜提取物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷小鼠的保護(hù)作用研究

胡力夫，蘇沛文，馮 微，孟凡欣

（吉林大學(xué) 珠海學(xué)院藥學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣東 珠海 519000）

大蒜（Allium sativumL.）為多年生百合科蔥屬植物蒜的地下鱗莖，起源于中亞和地中海地區(qū)，漢朝時(shí)期被引種到中國(guó)，9世紀(jì)傳入日本和南亞地區(qū)，16世紀(jì)前葉在非洲和南美洲出現(xiàn)栽培，18世紀(jì)傳入北美洲。大蒜早在《本草綱目》中就有記載：大蒜“通五臟，達(dá)諸竅，去寒濕，辟邪惡，消癰腫。”[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，大蒜主要有抵抗癌癥、消除腫瘤[2]、抗氧化、清除自由基、降低血糖、預(yù)防血栓[3]、保護(hù)肝臟及調(diào)節(jié)免疫力和提高身體免疫功能[4]的作用，此外還有減肥、美容、戒煙等功效[5]。大蒜提取物主要成分有蒜氨酸和環(huán)蒜氨酸、大蒜揮發(fā)油、蒜素、有機(jī)鍺、微量元素硒和維生素[6]。柴惠等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物對(duì)心血管疾病具有抑制作用；方歡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物可以增強(qiáng)小鼠的免疫能力。

肝臟是人體最大的腺體，其主要功能包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝以及膽汁的分泌[9]。許多化學(xué)藥品、藥物、異種生物、感染和酒精中毒等會(huì)誘發(fā)肝功能障礙。肝功能不全會(huì)導(dǎo)致肝硬化、肝炎、肝肥大、癌癥和肝衰竭[10]，嚴(yán)重的可能危害人類(lèi)健康，因此化學(xué)物質(zhì)引起的肝損傷應(yīng)引起廣大人民的重視。

國(guó)內(nèi)外研究肝損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕谢瘜W(xué)性肝損傷模型、免疫性肝損傷模型、藥物性肝損傷模型、酒精性肝損傷模型和缺血再灌注肝損傷模型[11]。各種肝損傷模型使用的致病物質(zhì)也不相同，化學(xué)性肝損傷常使用四氯化碳（CCl4）[12]、D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）[13]等，免疫性肝損傷常使用刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）[14]、卡介苗（bacille calmette-guerin，BCG）聯(lián)合細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[15]和D-GalN聯(lián)合LPS[16]等，藥物性肝損傷常用乙酰氨基酚（acetaminophen，AP）和異煙肼（isonicotinyl hydrazide，INH）聯(lián)合利福平（rifampicin，RIF）[17]等建立模型。

國(guó)內(nèi)已有報(bào)道，大蒜多糖和蒜氨酸都對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷小鼠有保護(hù)作用[18-19]，但關(guān)于大蒜提取物保肝作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。通常制備大蒜提取物時(shí)需要經(jīng)過(guò)醇沉處理，雖然可以將淀粉和蛋白質(zhì)除掉，但也將大蒜多糖這一有效成分一同去除，使大蒜提取物的保肝效果減弱，故本研究制備大蒜提取物時(shí)不經(jīng)過(guò)醇沉操作，最大程度保留大蒜保肝有效成分，以提高大蒜提取物的保肝效果。本研究以大蒜提取物為研究對(duì)象，使用四氯化碳飼喂小鼠建立化學(xué)性肝損傷模型，研究大蒜提取物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷小鼠的保護(hù)作用，為后續(xù)對(duì)大蒜提取物保肝作用的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雌雄美國(guó)癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（無(wú)特定病原（specificpathogen free，SPF）級(jí)，體質(zhì)量18～22 g）：北京斯貝福生物技術(shù)有限公司；四氯化碳（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；水飛薊賓膠囊：天津天士力制藥股份有限公司；10%多聚甲醛溶液（paraformaldehyde，PFA）：上海源葉生物技術(shù)有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、乳酸脫氫酶（lacticdehydrogenase，LDH）、還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）、膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）、白蛋白（albumin，ALB）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；總蛋白（total protein，TP）測(cè)定試劑盒：睿信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；1580R高速離心機(jī)：中國(guó)香港基因有限公司；F6配4GZL手持式均質(zhì)乳化機(jī)：金華市華海科教儀器廠(chǎng)；SHB-111A循環(huán)水式真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申順生物科技有限公司；M1-211A型微波爐：美的集團(tuán)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜提取物的制備

精確稱(chēng)量30 g去皮的大蒜瓣，使用微波爐進(jìn)行微波滅酶，微波功率400 W，微波時(shí)間3 min。加入4倍體積的蒸餾水勻漿3 min，攪拌提取10 min，3 500 r/min離心15 min，上層清液使用四層紗布和布氏漏斗真空抽濾后，收集真空抽濾瓶中的濾液。大蒜提取物中蒜氨酸含量為3%，總糖含量為38%。

1.3.2 化學(xué)性肝損傷模型的建立

ICR小鼠共76只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、模型組、大蒜提取物低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組12只動(dòng)物，灌胃體積0.1 mL/10 g體質(zhì)量，空白組與模型組均灌胃純水，低、中、高劑量組灌胃大蒜提取物的劑量分別為120 mg/（kg·d）、440 mg/（kg·d）、1 520 mg/（kg·d），陽(yáng)性對(duì)照組灌胃水飛薊賓，劑量為70 mg/（kg·d）。連續(xù)給藥14 d，期間各組小鼠自由飲水進(jìn)食，每周稱(chēng)量一次體質(zhì)量，并調(diào)整灌胃劑量，第14天建立四氯化碳肝損傷模型。以0.1 mL/10 g體質(zhì)量的灌胃劑量給予模型組、大蒜提取物低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組0.1%四氯化碳食用油溶液，空白組灌胃等劑量食用油。造模后禁食不禁水16 h，用眼球取血的方式收集小鼠血液，3 000 r/min離心10 min兩次，分離血清。取肝臟相同部分，加入9倍體積生理鹽水，冰水浴勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液待測(cè)。

1.3.3 小鼠血清及肝臟生化指標(biāo)測(cè)定

采用試劑盒測(cè)定小鼠血清及肝臟中總蛋白、白蛋白、谷胱甘肽的含量和小鼠血清及肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肝臟中膽堿酯酶的活力。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清和肝臟中AST、ALT和LDH活力測(cè)定結(jié)果

2.1.1 小鼠血清中AST、ALT和LDH活力測(cè)定結(jié)果

AST、ALT和LDH的活力可反映肝臟受損情況，這3種酶的活力越高表明肝臟損傷程度越高[20]。小鼠血清中AST、ALT和LDH活力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大蒜提取物對(duì)肝損傷小鼠血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶活性的影響Table 1 Effect of garlic extract on aspartate transaminase，alanine transaminase and lactic dehydrogenase activity in serum of mice with liver injury

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中AST、ALT和LDH活力極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明四氯化碳對(duì)小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中AST、ALT和LDH活力均降低，說(shuō)明大蒜提取物3個(gè)劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠血清中AST、ALT和LDH活力的不正常升高，其中，對(duì)于小鼠血清中AST活力，高劑量組作用極顯著（P＜0.01）；對(duì)于小鼠血清中ALT活力，低劑量組作用顯著（P＜0.05），中劑量組和高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）。

2.1.2 小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力測(cè)定結(jié)果

小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大蒜提取物對(duì)肝損傷小鼠肝臟中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶活性的影響Table 2 Effect of garlic extract on aspartate transaminase，alanine transaminase and lactic dehydrogenase activity in liver of mice with liver injury

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明四氯化碳對(duì)小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力均降低，說(shuō)明大蒜提取物3個(gè)劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠肝臟中AST、ALT和LDH活力的不正常升高，其中，對(duì)于小鼠肝臟中AST活力，中劑量組和高劑量組的作用顯著（P＜0.05）；對(duì)于小鼠肝臟中ALT活力，低劑量組的作用顯著（P＜0.05），中劑量組和高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）；對(duì)于小鼠肝臟中LDH活力，3個(gè)劑量組的作用都極顯著（P＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組也有極顯著作用（P＜0.01）。KODAI S等[21]研究表明，蒜氨酸可以抑制四氯化碳所致的小鼠ALT和LDH活力的不正常升高，其結(jié)果與本研究一致，說(shuō)明大蒜提取物對(duì)肝細(xì)胞的損傷確有保護(hù)作用。

2.2 小鼠血清和肝臟中ALB、TP和GSH含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的測(cè)定結(jié)果

肝的儲(chǔ)備功能可以由血清白蛋白的含量來(lái)反映，血清白蛋白的含量能表示肝臟的病變程度[22]，蛋白含量的水平能反映肝臟的合成能力，GSH的含量可以衡量機(jī)體抵抗氧化的能力[23]。小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大蒜提取物對(duì)肝損傷小鼠血清中白蛋白、總蛋白、谷胱甘肽含量的影響Table 3 Effect of garlic extract on albumin，total protein and glutathione content in serum of mice with liver injury

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中ALB、TP和GSH含量極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明四氯化碳對(duì)小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALB、TP和GSH含量均升高，說(shuō)明大蒜提取物3個(gè)劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的不正常降低。其中，對(duì)于小鼠血清中ALB含量，3個(gè)劑量組的作用都極顯著（P＜0.01）；對(duì)于小鼠血清中TP含量，高劑量組的作用顯著（P＜0.05）；對(duì)于小鼠血清中GSH的含量，高劑量組的作用顯著（P＜0.05）。

2.2.2 小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量的測(cè)定結(jié)果

小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大蒜提取物對(duì)肝損傷小鼠肝臟中白蛋白、總蛋白、谷胱甘肽含量的影響Table 4 Effect of garlic extract on albumin，total protein and glutathione content in liver of mice with liver injury

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量均極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明四氯化碳對(duì)小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟ALB、TP和GSH含量均升高，說(shuō)明大蒜提取物3個(gè)劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠肝臟中ALB、TP和GSH含量的不正常降低。其中，對(duì)于小鼠肝臟中ALB含量，高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）；對(duì)于小鼠肝臟中TP含量，中劑量組和高劑量組的作用顯著（P＜0.05）；對(duì)于小鼠肝臟中GSH含量，中劑量組和高劑量組的作用均極顯著（P＜0.01）。

劉靜[24]研究表明，連翹可以抑制四氯化碳所致的小鼠TP、ALB和GSH含量的不正常降低，從而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用，其結(jié)果與本研究一致。說(shuō)明大蒜提取物不僅在一定程度上可以修復(fù)損傷引起的肝臟合成能力下降[25]，還可以增加小鼠肝細(xì)胞抵抗氧化的能力，其機(jī)制可能是大蒜提取物誘導(dǎo)GSH的含量上升，為谷胱甘肽過(guò)氧化酶提供還原劑，使肝細(xì)胞膜對(duì)氧自由基的耐受性增加，從而保護(hù)肝細(xì)胞膜，使肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性增加、肝酶活降低，從而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用[26]。

2.3 小鼠肝臟中CHE活性測(cè)定結(jié)果

CHE又稱(chēng)假膽堿酯酶或非特異性膽堿酯酶，和白蛋白相比，膽堿酯酶半衰期短，且合成后立即釋放入血，其活性降低程度與肝細(xì)胞受損程度相一致，肝病越嚴(yán)重，膽堿酯酶下降的幅度越大，甚至膽堿酯酶比白蛋白在反映肝臟合成功能方面還要靈敏[27]。小鼠肝臟中CHE活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 大蒜提取物對(duì)肝損傷小鼠肝臟中膽堿酯酶活性的影響Table 5 Effect of garlic extract on choline esterase activity in liver of mice with liver injury

由表5可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟CHE活力極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明四氯化碳對(duì)小鼠肝臟造成了損傷，成功建立了肝損傷小鼠模型。與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟CHE活力均升高，說(shuō)明大蒜提取物3個(gè)劑量組可不同程度地抑制肝損傷小鼠肝臟中CHE活力的不正常降低。其中，高劑量組的作用極顯著（P＜0.01）。

從小鼠肝臟CHE測(cè)定結(jié)果可知，大蒜提取物能顯著抑制四氯化碳所致的小鼠CHE活力的不正常降低，說(shuō)明大蒜提取物能夠使受損肝臟的合成能力獲得改善，其機(jī)制可能是大蒜提取物可以增加細(xì)胞抵抗氧化的能力，以緩解肝臟受到自由基的損傷，從而達(dá)到抑制四氯化碳損傷肝臟的作用[28]。

3 結(jié)論

大蒜提取物可以抑制四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷小鼠血液及肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）活力不正常升高，并抑制總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷胱甘肽（GSH）含量及膽堿酯酶（CHE）活力不正常降低，說(shuō)明大蒜提取物可以通過(guò)提高肝細(xì)胞抗氧化能力，改善肝臟合成能力達(dá)到對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。