栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖毒理安全性評價

戴德慧，胡偉蓮

（浙江科技學院 生化學院，浙江 杭州 310012）

粘多糖是一類分子結構中含有糖醛酸和氨基己糖結構的糖胺聚糖，是多糖家族中最重要的成員之一[1-3]。粘多糖有著重要的生物學活性，能調節體內的陰離子濃度、機體免疫功能、機體脂類代謝；激活脂蛋白脂酶；防御細菌或病毒的感染；具有抗凝血、抗血栓活性、抗癌等多種生理功能[4-9]。此外，粘多糖在調節骨膠原纖維的生成及增加血管壁彈性等方面也均有重要作用[10-13]。隨著粘多糖特殊的結構性質和生物活性不斷被發現，粘多糖也被普遍認為是一類最具發展前景的生物活性物質之一。

目前，粘多糖產品的開發制備主要采用動物組織提取法，但這種生產方法原料來源局限性大、產品提取率極低、工藝程序復雜、生產成本居高不下，造成商品價格昂貴，難以進行大規模工業化生產。而采用微生物發酵法，具有原料不受限制，產品容易純化，成本低，且無動物來源致病病毒來源的污染的危險，易于形成規模化生產[14-15]。利用獸疫鏈球菌（Streptoccus zooepidemicus）發酵生產的透明質酸是微生物粘多糖中最重要的代表，已廣泛應用于食品、化妝品和醫療等領域[16-17]。

在騰格里沙漠的南緣地區篩選得到一株栗樹類芽孢桿菌（Paenibacillus castaneae）S3，其能在營養貧瘠的無氮蔗糖培養基中較好的生長，自生固氮并產大量的胞外粘多糖。該粘多糖具有較好的保溫、防粘連及絮凝作用，在食品、醫藥、化妝品及環保等領域具有廣泛的應用前景，但其是否存在安全隱患尚不清楚。因此，本研究通過小鼠急性經口毒性試驗、骨髓細胞染色體畸變、精子畸形及30 d喂養試驗分別考察栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖的急性毒性、致突變、遺傳及亞急性毒性等進行初步的安全性評價，為其今后的開發利用提供毒理學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）清潔級小鼠：浙江省實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（浙）2014-0001號。所有小鼠均喂養于屏障環境（空氣潔凈度萬級，換氣次數10～20次/h，溫度20～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%），小鼠飼喂60Co滅菌的營養配合飼料，飲用超濾水，籠器具、墊料等均經121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.2 試劑

蔗糖、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；環磷酰胺（分析純）：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；秋水仙素、氯代十六烷基吡啶（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

發酵培養基：蔗糖30 g，硝酸鈉1g，磷酸氫二鉀1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BSA224S、BSA2202S電子天平：上海賽多利斯貿易有限公司；日立7100型全自動生化分析儀：日本日立公司；X-30R離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；CX33生物顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；LRH-70生化培養箱：上海一恒實驗設備有限公司；GI54DWS高壓滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；ZWYR-2112B型恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；ADVIA 2120I全自動血液分析儀：德國西門子公司；Alphaclean1300垂直流潔凈工作臺：力康生物醫療科技控股有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胞外粘多糖的制備[18]

按3%（V/V）的接種量將栗樹類芽孢桿菌（Paenibacillus castaneae）S3菌懸液（106CFU/mL）接種于發酵培養基，裝液量50 mL/300 mL，于28 ℃、180 r/min條件下搖瓶培養48 h，得到發酵液。將發酵液經5 000 r/min離心20 min，除去菌體，加入終濃度為0.1 mol/L的NaCl，再加入1%氯代十六烷基吡啶（cetylpyridinechloride，CPC）處理，使其形成絡合沉淀后，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，以0.6 mol/L NaCl溶液充分溶解沉淀，然后加3倍體積的無水乙醇，4 000 r/min離心20 min，收集白色絮狀產品，冷凍干燥，得到粘多糖樣品。

1.3.2 小鼠急性經口毒性試驗[19-20]

選用ICR清潔級小鼠，體質量為18～24 g，雌雄各10只，灌胃前16 h禁食，稱質量后，24 h內分3次灌胃給予質量濃度為0.1 g/mL的受試物，灌胃容量為40 mL/kg體質量，累計受試物總劑量為12 g/kg體質量。灌胃4 h后給食，給藥后連續觀察14 d，記錄中毒表現及死亡情況。給藥14 d后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，進行心、肝、脾、肺、腎、子宮、睪丸、胃、腸等重要臟器病理檢查。另選用相同數量的小鼠，在同樣的處理方式下，以蒸餾水取代受試物作為對照組。

1.3.3 小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗[21]

選用體質量為25～30 g的健康ICR清潔級小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。制備的粘多糖樣品分為低（1.0 g/kg體質量）、中（2.0 g/kg體質量）、高（4.0 g/kg體質量）三個劑量試驗組，采用環磷酰胺（cyclophosphamide，CP）（40 mg/kg）為陽性對照組，蒸餾水為陰性對照組，給予受試物3次，每次間隔24 h，在末次給受試物24 h后取材，處死動物前2 h按4 mg/kg體質量腹腔注入秋水仙素。小鼠頸椎脫臼處死取股骨，將骨髓洗入10 mL離心管中，反復沖洗數次后，混勻，制成1.0 mL細胞懸液，采用Giemsa染色儲備液染色，用油鏡對細胞中期的染色體進行分析觀察，每只動物分析100個中期相細胞，計算染色體異常率，即染色體異常數與總分析數的比值。

1.3.4 小鼠精子畸形試驗[22]

選用體質量為28～35 g的雄性ICR清潔級小鼠25只，隨機分為5組，每組5只。設置試驗組（劑量分別為低（1.0 g/kg體質量）、中（2.0 g/kg體質量）、高（4.0 g/kg體質量）、陰性對照組（蒸餾水）和陽性對照組（50 mg/kg體質量CP），連續灌胃給予受試物5 d，至首次給受試物后的第35天，用頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側副睪，放入盛有2 mL生理鹽水的平皿中。用眼科剪將副睪縱向剪1～2刀，靜置3～5 min，輕輕搖動。用合成纖維血網袋過濾，吸濾液涂片。空氣干燥后，用甲醇固定5 min以上干燥，用1.5%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥。每組記數5只動物，每只動物計數1 000個結構完整的精子，計算精子畸形率（以百分率計）。

1.3.5 30 d喂養試驗[23]

選用體質量為18～24 g的ICR清潔級小鼠80只，隨機分成4組，每組20只，雌雄各半。設置試驗組（劑量分別為低（1.0 g/kg體質量）、中（2.0 g/kg體質量）、高（4.0 g/kg體質量）、對照組（蒸餾水）。實驗期間每天觀察小鼠一般狀態、體征、攝食量、飲水及糞便狀況。每7 d測一次體質量，按體質量變化調整給藥量，連續觀察30 d。給藥期滿30 d，禁食禁水12 h后，摘眼球取血，檢查血液常規指標及血液生化指標。取血后立即剖取動物肝、腎、脾、胃、睪丸或卵巢等臟器稱質量，根據體質量計算器官質量系數，并進行病理組織學檢查。

1.3.6 數據統計分析

采用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠急性經口毒性試驗結果

小鼠急性經口毒性試驗體質量增長情況見表1。

由表1可知，給予受試物的樣品組雄雌小鼠體質量增長與對照組無明顯差異（P＞0.05），給藥14 d后小鼠外觀毛色光亮，無興奮、不安、竄動、跳躍、豎毛、流淚、流涎、凸眼、扭體反應現象；給藥后攝食、取水、大小便等均無明顯異常；觀察期間無動物死亡；給藥14 d 后小鼠的心、肝、脾、肺、腎、子宮、睪丸、胃、腸等重要臟器均未見出血、充血、水腫、滲出、潰瘍、穿孔等明顯的病理變化，胸腔、腹腔、心包膜無積液。結果表明，對于粘多糖，雌雄兩性小鼠經口最大耐受度均＞12 g/kg。根據急性毒性分級，粘多糖樣品屬無毒級[24-25]。

2.2 小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗結果

小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗結果見表2。

由表2可知，試驗組小鼠的染色體異常率（4.20%、4.20%、4.00%）與陰性對照組（4.70%）無明顯差異（P＞0.05），與陽性對照組（45.3%）差異極顯著（P＜0.01），且試驗組結果顯示染色體異常率無劑量反應關系。結果表明，該粘多糖樣品劑量為0～4.0 g/kg時無致小鼠骨髓細胞染色體畸變的作用。

表2 小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗結果Table 2 Results of chromosome aberration tests in mice bone marrow cells

2.3 小鼠精子畸形試驗結果

小鼠精子畸形試驗結果見表3。

由表3可知，試驗組小鼠精子的畸形率（2.14%、2.04%、2.06%）與陰性對照組（2.56%）比較，無顯著差異（P＞0.05），與陽性對照組（7.68%）比較，差異極顯著（P＜0.01），且試驗組結果顯示染色體畸變率無劑量反應關系。結果表明，該粘多糖樣品劑量為0～4.0 g/kg時對小鼠精子無畸變作用。

表3 小鼠精子畸形試驗結果Table 3 Results of sperm abnormality tests in mice

2.4 30 d飼喂試驗結果

2.4.1 一般毒性反應

高、中、低三個劑量給藥組及對照組小鼠在30 d試驗期內均活動正常，行為活潑，毛色光澤，進食飲水正常，大、小便無異常改變，無一死亡。

2.4.2 體質量測定結果

表4 30 d喂養試驗中小鼠體質量測定結果Table 4 Determination results of mice body weight in 30 d feeding tests

由表4可知，高、中、低三個劑量給藥組體質量增長正常，試驗組與對照組相比較，差異不顯著（P＞0.05）。

2.4.3 小鼠臟器系數測定結果

由表5可知，給藥30 d后，3個劑量試驗組的肝臟、脾臟、腎臟、睪丸及卵巢臟器系數與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 30 d喂養試驗中小鼠臟器系數測定結果Table 5 Determination results of mice organ coefficient in 30 d feeding tests

2.4.4 血常規指標測定結果

由表6可知，各劑量組小鼠白細胞數量（white blood cell，WBC）、紅細胞數量（red blood cell，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）濃度、紅細胞壓積（hematokrit，HCT）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血小板容積（mean platelet volume，MPV）、平均紅細胞血紅蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）含量、嗜中性白細胞（neutrophil，NE）百分比、淋巴細胞（lymphocyte，LY）百分比、嗜酸性粒細胞（eosnophils，EOS）百分比、單核細胞（monocyte，MONO）百分比、嗜堿性粒細胞（basophil，BAS）、平均紅細胞血紅蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）濃度、紅細胞分布寬度（red blood cell distribution width，RDW）、血小板（platelet，PLT）數量均與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

表6 30 d喂養試驗中小鼠血常規指標測定結果Table 6 Determination results of mice blood routine indexes in 30 d feeding tests

2.4.5 血生化指標測定結果

表7 30 d喂養試驗中小鼠血生化指標測定結果Table 7 Determination results of mice blood biochemistry indexes in 30 d feeding tests

續表

由表7可知，各劑量組小鼠的甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、谷草轉氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）、谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、葡萄糖（glucose，GLU）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）血生化指標與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4.6 30 d喂養小鼠的病理組織學檢查

全面細致觀察發現，各小鼠的心、肝、腎、脾、胃、睪丸及卵巢等器官的大小、形態、色澤、質感等均未見異常。各主要臟器無明顯變性、壞死，光澤正常。

3 結論

通過小鼠急性毒性試驗，確定栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖樣品對雌雄性小鼠的急性毒性最大耐受度均＞12 g/kg，屬無毒物。通過小鼠骨髓細胞染色體畸變及精子畸形試驗，確定栗樹類芽孢桿菌S3胞外粘多糖樣品低（1.0 g/kg）、中（2.0 g/kg）、高劑量（4.0 g/kg）對小鼠的染色體及精子無畸變作用。通過小鼠30 d喂養試驗表明，試驗期內各組小鼠生長發育良好，體質量增加、臟器系數、血常規及血生化各項指標與對照組均無顯著差異（P＞0.05））；病理組織學檢查均未見病理改變。