五株海藻次級代謝產物化學篩選

艾麗絲，林圣楠，但阿康，林向陽

（福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

海洋被譽為資源能源寶庫[1]。海藻（algae）在生物資源中扮演著重要的角色。全球海藻共有3萬多種，人類大量開發利用的藻主要有四類——紅藻（Rhodophycea）、褐藻（Phaeophyceae）、綠藻（Chlorophyta）、藍藻（Cyanophyta）[2]。海藻中含有豐富的活性物質，這些生物活性物質主要有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫調節、抗輻射、抗衰老、抗氧化等作用[3]。

海藻是一種具有綠色保健功效的天然食材，近幾年來，有很多對海藻提取物在食品中應用的報道[4-5]。研究發現，裙帶菜海藻在烹飪面食時可以明顯改善部分面食的口感[6]，香腸中加入海藻能夠改善食用纖維含量，使香腸低鈉高鈣；加入裙帶菜海藻可以增加礦物質含量，鈉鉀比無明顯影響[7-8]。RAO P V等[9]對不同地方食用的越南紫菜進行分析，得出越南海帶中礦物成分相比蔬菜和其他食用海藻均較高且含有益壽飲食物質。海藻中還能夠提取出有保健功能及療效的活性物質，目前海藻中抗病毒、抗腫瘤和治療心血管疾病這3個方面的活性物質被重點關注[10-11]。ARAU′JO I W F D等[12]從新月藻中分離出具有顯著鎮痛和抗炎作用的硫酸多糖，且該物質在對小鼠使用時沒有顯示任何毒性跡象。KWON H J等[13]發現小珊瑚藻的乙醇提取物對人體宮頸腺癌細胞株和子宮頸癌傳代細胞有治療作用。另外紅藻中的卡拉膠、瓊膠和褐藻中的褐藻膠三種凝膠，已經作為凝膠劑、乳化劑和增稠劑等應用在化妝品中；巨藻因其能促進細胞再生、保持皮膚健康而出名；來源于褐藻的巖藻多糖和巖藻黃素在市場上也是常見的海藻護膚產品[14-16]。

紅藻是很古老的藻類，江蘺（Gracilaria）就是紅藻中的一員。江蘺屬于江蘺科、江蘺屬，由于江蘺的生長分布非常廣，江蘺的種類也非常的豐富[17]，該研究的江蘺品種為細基江籬（Gracilaria tenuistipitata）；麒麟菜（Eucheuma muricatum）分為刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）和異枝麒麟菜（E.striatum），是紅藻門紅翎科植物全藻體，別名雞膠、雞腳菜等。藻體形態多為分枝狀細圓柱體，具刺狀或者錐形實體，生長于有珊瑚礁的巖石上[18]；石花菜（Gelidium amansii）別名洋菜、燕菜精、石生花等，具有高食療高經濟價值。石花菜在植物學上為紅藻門[19-20]，大部分呈現紫色偏紅，不過因為生長環境以及自然條件的不同，有的也會呈現深紅色或者暗紫色[21]。小球藻（Chlorella vulga）屬于單細胞綠藻，是球形單細胞淡水藻類的一種，直徑約為3～8 μm，廣泛分布于淡水水域，種類也最多[22]。它容易于培養，除了能利用光能自養，還能在異養條件下進行生長、繁殖，其應用及食用價值很高[23]。

本研究著重于紅藻類中的江籬（Gracilaria）、刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）、異枝麒麟菜（E.striatum）、石花菜（Gelidium amansii）以及綠藻類中的小球藻（Chlorella vulga）五株不同藻種的次級代謝物質篩選；通過薄層層析色譜（thin layer chromatography，TLC），高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析探討五株海藻次級代謝產物的豐富度，為海藻在食品、藥物和化妝品上的后續研發提供有利的實驗基礎保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江籬（Gracilaria）、刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）、異枝麒麟菜（E.striatum）：綠新集團；石花菜（Gelidium amansii）：青島海悠悠商貿有限公司；小球藻（Chlorella vulga）：上海光語生物科技有限公司；乙酸乙酯（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；1-二苯基-2-苦基肼自由基：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；石油醚（60～90 ℃）、甲醇（色譜級）、乙醇、香蘭素（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸：衡陽市凱信化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-100紫外可見光光度計：上海美普達儀器有限公司；WFH-203B三用紫外分析儀：上海精科實業有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；Primaide高效液相色譜儀：天美（中國）科學儀器有限公司福州分公司；ultimate分析型反向C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：月旭科技（上海）股份有限公司；7890-B/5977A氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方式

（1）將海藻（江蘺，刺麒麟菜，異枝麒麟菜，石花菜，小球藻）分別用清水洗凈。在陽光下進行自然風干后，使用研磨機粉碎并100目篩子過篩，收集海藻粉末。

（2）取1.5 kg海藻粉末放入提取缸中，倒入體積分數95%乙醇溶液至完全浸沒，置于55 ℃的溫水浴中提取24 h，用真空旋轉蒸發器將提取液蒸干，所得的回收液繼續用于提取。反復提取直至提取液顏色變淡呈澄清透明狀（約4次）。蒸干所得的浸出物用于下一步分離萃取。

（3）將上一步得到的浸出物用體積分數為90%甲醇-水溶解，用等體積石油醚萃取3次，合并3次萃取液；蒸干得到石油醚相。將之前萃取后90%甲醇-水配制成10%甲醇-水，用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，蒸干得到乙酸乙酯相。萃取后的10%甲醇-水蒸干。

（4）將上一步所得分離物分別用石油醚（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、水進行溶解，并于冰箱中保存待用。

1.3.2 薄層層析色譜

（1）點樣：用溶劑將試樣溶解，終質量濃度為100 mg/mL，然后用毛細管（內徑0.5 mm）吸取少許試樣溶液在熒光薄層硅膠板上進行點樣（為大小均勻的小圓點，且應大小適宜）。一個平板上分別點上水、石油醚、乙酸乙酯層的分離物，以便對比，每個點的距離相等，且不宜太過靠近邊沿。

（2）展開：用電吹風（冷風，以免破壞樣品）將樣點吹干，然后將熒光薄層硅膠板豎直放入裝有展開劑的有蓋的展開玻璃槽中。展開劑不能接觸到樣品點，但必須接觸到吸附劑的下沿。將展開槽蓋上蓋子，展開。等待展開劑上行到TLC板的上端（事先確定好的溶劑前沿線），最后取出薄層板，自然晾干。

（3）顯色：首先在波長254 nm的紫外光下操作，標出其熒光區域，最后用硫酸香草醛顯色劑浸泡后于用電吹風（熱風，大風力）加熱并吹干，使其顯色。

1.3.3 高效液相色譜分析

將不同洗脫梯度下的粗提取物蒸干，然后取1 mL 100 mg/mL的提取物，將其溶于甲醇中，使用微濾膜進行過濾，進行高效液相色譜分析。分析條件：n=210 nm，254 nm；溫度25 ℃；載體流速2 mL/min；進樣量20 μL。

洗脫條件為0 min：90%超純水，10%甲醇；0～45 min：90%超純水～0%超純水，10%～100%甲醇；45～60 min：100%甲醇；檢測器：UV檢測器。

1.3.4 氣相色譜-質譜聯用

（1）化學成分的分離與鑒定：取少量石油醚，加入到石油醚提取物中溶解，溶解后用過濾針筒進行過濾，每次抽取1 mL，然后置于進樣瓶中進樣，用氣相色譜-質譜聯用儀進行分析，通過NIST 08譜庫對各組分的質譜數據進行檢索分析，確定各組分物質，用氣相色譜峰面積歸一化法進行計算，得出含量。

（2）氣相色譜條件：色譜柱DB-wax極性柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm），進樣口溫度240 ℃，柱箱溫度260 ℃，采用程序升溫：60 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持4 min，以8 ℃/min升至240 ℃，保持30 min，柱流量2.0 mL/min，進樣量1.0 mL，分流比10∶1。

2 結果與分析

2.1 海藻乙酸乙酯相的薄層層析色譜分析

將得到的海藻利用試劑比例為石油醚∶乙酸乙酯=10∶1的展開劑進行TLC分析，結果見圖1。

圖1 五種海藻乙酸乙酯相薄層層析分析色譜圖Fig.1 Thinner layer chromatogram of ethyl acetate phase of five species of algae

由圖1可知，通過觀察五種海藻石油醚∶乙酸乙酯=10∶1洗脫的薄層層析色譜分析結果，可以發現江蘺有兩條顯色明顯的條帶，石花菜有三條顯色明顯的條帶，說明江蘺和石花菜次級代謝產物較豐富，并且易于提取分離。

2.2 海藻乙酸乙酯相的高效液相色譜分析

五種海藻的乙酸乙酯相組分的HPLC圖譜見圖2。由圖2可知，其中，江蘺、石花菜和小球藻在210 nm波長下具有明顯的紫外吸收峰，在254 nm波長處沒有明顯的紫外吸收峰，而刺麒麟菜和異枝麒麟菜在210 nm和254 nm波長下都有明顯的紫外吸收峰；江蘺和石花菜在保留時間5～10 min處出現兩個大峰，刺麒麟菜和異枝麒麟菜在保留時間5～15min處出現四個大峰，保留時間較近，推斷為大極性具有紫外吸收的代謝產物；江蘺和石花菜在保留時間20～35 min處出現三個大峰，刺麒麟菜和異枝麒麟菜在保留時間20～40 min出現5個大峰，小球藻在保留時間30 min左右出現一個大峰，保留時間45～55 min出現一些臨近的大峰，它們的保留時間相差較大，推斷為中極性和小極性具有紫外吸收的代謝產物。

圖2 五種海藻的乙酸乙酯相高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of ethyl acetate phase of five species of algae

綜合觀察發現，江蘺、刺麒麟菜、異枝麒麟菜、石花菜均在5～15 min出現大峰并且保留時間相似，可能為同一化合物，故研究其中一種海藻就有可能得到這4種海藻共同的化合物，同時江蘺、刺麒麟菜、異枝麒麟菜的其他出現大峰的保留時間也較相似，可能為海藻中較常見代謝產物，不具有研究價值。而石花菜與江蘺、刺麒麟菜、異枝麒麟菜相比，有三個峰是保留時間相差較大，峰面積較大，易于提取并且具有與其他海藻不同的化合物，具有一定的研究價值。將小球藻與以上4種海藻對比發現，其峰較集中在極性較低的區域，不易提取純化。

2.3 海藻石油醚相氣相色譜分析

五種海藻石油醚相氣相色譜圖見圖3。由圖3可知，江蘺有6個峰；刺麒麟菜有6個峰；異枝麒麟菜有5個峰；石花菜有5個峰；小球藻有8個峰。

圖3 五種海藻石油醚相氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of petroleum ether phase of five species of algae

江蘺的石油醚相成分分析結果（表1）可知，江籬石油醚相的成分組成共檢測出31種物質，成分較為復雜，主要分為以下幾類：酸（80.71%）、醇（1.32%）、酯（2.06%）、醛（2.02%）、烷烴（3.27%）、酮類（1.59%），其中成分最多為棕櫚酸，相對百分比為76.73%。

刺麒麟菜的石油醚相成分分析結果（表2）可知，刺麒麟菜石油醚相的成分組成共檢測出29種物質，成分較為復雜，主要分為以下幾類：酸（80.4%）、酯（0.49%）、烷烴（2.74%）、酮類（1.32%），其中成分最多的為十六酸，相對百分比為65.94%。

表1 江蘺石油醚相成分分析Table 1 Composition analysis of petroleum ether phase of Gracilaria tenuistipitata

表2 刺麒麟菜石油醚相成分分析Table 2 Composition analysis of petroleum ether phase of Eucheuma spinosum

續表

異枝麒麟菜石油醚相成分分析結果（表3）可知，異枝麒麟菜的石油醚的成份組成共檢測出19種物質，主要分為以下幾類：酸（83.05%）、烷烴（3.03%）、酮類（1.27%），其中成分最多的為十六酸，相對百分比為78.94%。

表3 異枝麒麟菜石油醚相成分分析Table 3 Composition analysis of petroleum ether phase of Eucheuma striatum

石花菜的石油醚相成分分析結果（表4）可知，石花菜石油醚的成分組成共檢測出33種物質，成分較為復雜，主要分為以下幾類：酸（73.08%）、醇（0.61%）、酯（5.68%）、烷烴（8.99%），其中成分最多為十六酸，相對百分比為65.42%。

表4 石花菜石油醚相成分分析Table 4 Composition analysis of petroleum ether phase of Gelidium amansii

小球藻石油醚相成分分析結果（表5）可知，小球藻石油醚相成分組成共檢測出36種物質，成分較為復雜，主要分為以下幾類：酸（10.11%）、醇（5.71%）、酯（70.25%）、烷烴（0.93%）、醛類（0.03%）、酮類（1.11%），其中成分最多為亞油酸乙酯，相對百分比為29.41%。

表5 小球藻石油醚相成分分析Table 5 Composition analysis of petroleum ether phase of Chlorella vulga

分析結果對比發現，石花菜、小球藻具有除酸類化合物外的其他復雜有機化合物，并且種類多，成分復雜，未知種類具有一定數量。特別是小球藻較于其他海藻來說，酯類含量豐富，易于提取不飽和脂肪酸。

3 結論

本實驗主要通過化學篩選方法（TLC，HPLC，GC-MS）對五種海洋海藻進行了初步化學篩選。通過TLC分析得出江蘺和石花菜顯色明顯，代謝產物豐富；再通過HPLC分析得出石花菜的乙酸乙酯相代謝產物極性相差較大，多為中、小極性化合物，易于提取分離具有一定價值的化合物；結合GC-MS分析得出，石花菜、小球藻的石油醚相具有除酸類化合物外的其他復雜有機化合物，種類多，成分復雜，未知化合物具有一定數量，可深入進行研究，但小球藻的HPLC結果顯示它提取純化難度極大。因此，綜合TLC、HPLC和GC-MS的結果得出，石花菜最適合進行下一步的研究。此化學篩選僅能初步判斷代謝產物的豐富度以及分離純化方法，進一步研究還需結合生物活性篩選，將會大大提高海藻產品研發實驗效率。