葡萄酒高級醇檢測方法的優化及其在本土釀酒酵母篩選中的應用

王雅楠，王 倩，劉延琳，2，宋育陽，2，秦 義，2，3

（1.西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100；3.西北農林科技大學 合陽葡萄試驗示范站，陜西 合陽 715300）

高級醇（又稱雜醇）一般指具有兩個以上的碳原子的一元醇[1]，酵母碳代謝和氨基酸代謝途徑中的重要副產物[2]，常見于各類酒精飲品中，在葡萄酒中主要以異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇等為主導[3]。低濃度的高級醇和它們的酯，對葡萄酒的風味和香味起著關鍵作用[4-5]，但高濃度雜醇給葡萄酒帶來異味，容易引起飲酒后“上頭”，甚至給身體健康造成傷害[6-9]。在我國部分葡萄酒產區，受原料、工藝等影響導致酒中高級醇含量通常偏高，因此，對于這些產區內的葡萄酒生產企業而言，利用經濟、簡便的高級醇檢測分析手段，發現并控制葡萄酒中高級醇的來源，是亟需解決的技術問題。

葡萄酒中高級醇的檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和比色法（GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒及配制酒衛生標準的分析方法》）[10]。氣相色譜法和氣質聯用法可以利用高級醇標準品，對葡萄酒的單個高級醇進行相對定量或者絕對定量，分析準確性較高，是目前實驗檢測使用較為普遍的方法，但存在標準樣品昂貴且不便保存、樣品前處理操作復雜、設備價格昂貴等缺點[11]，并不適宜國內眾多中小型酒類生產企業在生產過程中快速檢測的實際需要和實驗室以高級醇含量為觀測點的大批量菌株的快速初篩。比色法則起初用于蒸餾酒中雜醇的檢測，其根據高級醇（正丙醇除外）與濃硫酸脫水轉化為不飽和烴，與對二甲胺基苯甲醛發生縮合反應，生成橙黃色化合物的原理來測定。該法操作簡單，不需要昂貴檢測設備，檢驗量大且經濟，依然是生產企業實際生產中適用的方法。但是比色法除了不能定量單一高級醇的缺陷外，還存在加熱溫差大容易導致爆管、針對葡萄酒檢測條件不明晰、干擾因素多、顯色不穩定等問題。

葡萄酒中的高級醇產量一方面與釀造工藝技術有關，如葡萄汁初始糖含量[12]、氮源的種類[13-14]及含量[15-16]，發酵溫度，pH值、溶氧量和貯存時間等；另一方面，由于葡萄酒中的高級醇主要是酵母代謝產生[20]，研究人員主要圍繞酵母的Ehrlich途徑，通過測序研究其基因結構及功能[21]，以及通過基因調控互作[22-24]研究等，來揭示酵母的高級醇代謝調控途徑，從而為低產高級醇酵母的基因工程育種提供理論支撐。

本研究在國標比色法[27]和前人研究的基礎上[12，26-27]進行多個條件優化，建立了一種顯色穩定、能夠準確檢測高級醇含量的方法，隨后以商業酵母CECA為對照，采用優化比色法和GC-MS法對課題組核心酵母種質資源庫中的6株本土釀酒酵母產高級醇能力進行檢測分析，旨在篩選得到具有較好發酵特性且低產高級醇的本土釀酒酵母，為實際生產提供應用指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料為本實驗室前期從新疆、寧夏、內蒙古葡萄酒產區篩選得到的發酵性能優良、具有商業化潛力的6株本土釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），對照菌株為商業酵母CECA，均于實驗室-80 ℃冰箱中保存。

對二甲氨基苯甲醛：上海葉源生物科技公司；異戊醇、異丁醇等高級醇標準品（均為色譜純）；無水乙醇、濃硫酸、吐溫80（均為國產分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。對二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液（5 g/L）：0.5 g對二甲氨基苯甲醛加硫酸溶解至100 mL。高級醇標準使用液：稱取0.08 g異戊醇，0.02 g異丁醇，50 mL無雜醇油乙醇，定容至100 mL配成高級醇標準溶液Ⅰ，隨后吸取5 mL溶液Ⅰ到50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度線（相當于0.1 mg/mL高級醇）。酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基、Triple M模擬葡萄汁[28]：自制。

1.2 儀器與設備

UV1800 紫外分光光度計：日本島津公司；7890B GC、5975B MS氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；BK1301生物顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；ELX800酶標儀：美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

-80 ℃取菌，YPD固體培養基劃線培養，挑單菌落進行二次純化，鏡檢后接入50mLTripleM模擬汁中28℃、150r/min培養24 h，隨后以5×105CFU/mL接入300 mL模擬汁中，每株菌設置3個平行，模擬白葡萄酒發酵條件25 ℃靜置發酵。每天監控CO2質量損失，待糖降至4 g/L以下結束發酵，裝入100 mL樣品瓶中存放于-30 ℃冰箱待測。測定殘糖采用3,5二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[29]。

1.3.2 比色法測定酒中的高級醇含量

國標法常用于蒸餾酒中高級醇的檢測，具體測步驟詳見GB/T5009.48—2003《蒸餾酒及配制酒衛生標準的分析方法》[27]，其標準曲線繪制所用高級醇標準使用液的體積按照0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1 mL加入反應體系，比較高級醇質量濃度在0～40 mg/L、0～50 mg/L、0～60 mg/L、0～70 mg/L和0～100 mg/L間的線性關系。優化實驗則通過使用乙醇檢測剩余的蒸發餾出液作為檢測初始樣品以簡化復雜的前處理步驟，后分別對酒樣稀釋倍數（未稀釋，稀釋5、10、20倍）、加樣靜置時間（1 min、3 min、5 min）、水浴條件（100 ℃15 min、90 ℃20 min、80 ℃20 min、90 ℃30 min、80 ℃30 min）和稀釋劑種類（水、50%硫酸溶液、濃硫酸）進行優化條件探索，搖勻10 min后，用1 cm比色杯以“0”調節零點，波長520 nm處測吸光度值，每個樣品平行檢測5次，測定結果及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.3 GC-MS法測定酒中的高級醇含量

參考蔡建[30]的檢測方法。標準溶液配制：將內標物4-甲基-2-戊醇（1.0 g/L）及醇類標準物溶于酒精度12%vol、酸7 g/L（以酒石酸計）、pH3.3、葡萄糖2 g/L的模擬汁中，現配現用保存于4 ℃。

頂空固相微萃取：AgilentPALRSI85進樣系統，吸取5mL的酒樣、1 g NaCl置于15 mL樣品瓶，PTFE-硅隔膜蓋緊，400 r/min、40 ℃條件下加熱30 min，后解吸25 min。

GC-MS條件：HP-INNOWAX毛細管柱（60mm×0.25mm×0.25 μm）；載氣高純氦氣（He）（流速1 mL/min）；250 ℃熱解吸25 min，柱溫箱的升溫50 ℃保持1 min，以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持5 min；質譜接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；質量掃描范圍29～350 u；運行時間62.67 min；每個樣品重復兩次。依據標樣色譜保留時間、質譜信息，比對美國國家生物信息中心（national center of biotechnology information，NIST）14.L標準譜庫進行定性分析，采用內外標法進行定量分析。

1.3.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 葡萄酒高級醇檢測方法的優化

2.1.1 待測樣品的稀釋

實驗首先利用國標法測定高級醇質量濃度在0～40mg/L、0～50 mg/L、0～60 mg/L、0～70 mg/L和0～100 mg/L間的線性關系，結果見圖1。

圖1 高級醇標準曲線Fig.1 Standard curve of higher alcohol

由圖1可知，高級醇檢測濃度與吸光度值在一定范圍內才具有良好線性關系，當檢測樣品的高級醇含量在不高于40 mg/L時，最大吸光度值達0.351 1，其線性系數（R2）可以達到0.999，而當高級醇質量濃度超過70 mg/L時，其吸光度值極不穩定。在葡萄酒中，高級醇含量一般在90～300 mg/L范圍內，常高于標準曲線的最高檢出濃度，因此針對葡萄酒樣品檢測分析時，有必要將樣品的高級醇濃度進行稀釋。

而在國標法中并未明確規定樣品稀釋倍數，本實驗將同一發酵酒樣分別進行不稀釋、稀釋5倍、10倍和稀釋20倍進行吸光度值和相對標準偏差比較，結果見圖2。

圖2 酒樣稀釋倍數對吸光度值及精密度的影響Fig.2 Effect of sample dilution times on absorbance and precision

由圖2可知，4種處理的吸光度隨著稀釋倍數的增加而逐漸減小，且RSD均在5%以內，其中未稀釋酒樣精密度雖最好但平均吸光值達0.982 6，顯著高于標準曲線最高檢出限，而剩余3種處理中稀釋20倍的樣品其標準偏差最小，表示精密度更高，顯色也更穩定。

2.1.2 加樣靜置時間、稀釋劑及反應體系條件的優化

將稀釋后的酒樣置于試管中，沿管壁緩慢加入二甲氨基苯甲醛-硫酸顯色劑，等其沉至管底后再將各管同時搖勻進行加熱，不同靜置時間對檢測值的影響見圖3。

圖3 加樣靜置時間對吸光度值及精密度的影響Fig.3 Effect of sample standing time on absorbance and precision

由圖3可知，靜置時間與吸光度值成反比，與RSD值成正比，即靜置時間越短顯色度和精密度越高。從反應穩定性和顯色強度來考慮，在加樣后靜置1 min時，吸光度值為0.409±0.014，RSD（3.45%）最低，為最優實驗水平。因此，實驗要求加樣盡量迅速并把控時間在1 min內，避免靜置時間過長導致吸光度值及精密度過低的問題。

GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準的分析方法》中選擇蒸餾水作為樣品稀釋劑，本實驗分別比較了蒸餾水、50%硫酸溶液和濃硫酸作稀釋劑對檢測值的影響，結果如圖4所示。

圖4 稀釋劑種類對吸光度值及精密度的影響Fig.4 Effect of diluent type on absorbance and precision

由圖4可知，以濃硫酸為稀釋劑時，因硫酸液體黏稠等因素，會造成檢測結果的精密度偏低。而將濃硫酸稀釋至50%硫酸溶液后，實驗精密度較水和濃硫酸條件下提高近1倍，且吸光度平均值為0.482±0.028，與以水為稀釋劑（0.439±0.043）無顯著差異。綜上，50%硫酸溶液較水精密性更好，較濃硫酸更具經濟效益和安全性。

GB/T 5009.48—2003中，需要將盛有反應體系的玻璃試管從沸水中立即放入冰水中，但由于溫差懸殊，容易造成爆管、鼓塞等，給實驗帶來諸多不便，因此需要進行水浴條件優化。以100 ℃沸水浴15 min為對照，進一步比較90 ℃水浴20 min、30 min及80 ℃水浴20 min、30 min的吸光度值和精密度，結果見圖5。

圖5 水浴條件對吸光度值及精密度的影響Fig.5 Effect of water-bath conditions on absorbance and precision

由圖5可知，與沸水浴15 min相比較，90 ℃水浴30 min和80 ℃水浴30 min，樣品檢測的吸光度值無顯著差異，但80 ℃水浴30 min條件下，其精密度RSD（4.08%）是最高的，這說明80 ℃水浴30 min處理反應體系可以在不影響吸光度值的前提下讓顯色更穩定，同時溫和的反應條件也大大降低了爆管風險。

2.1.3 優化方法的精密度和回收率

通過對實驗條件的分析，發現當葡萄酒酒樣在梯度稀釋20倍，加樣靜置1 min，80 ℃水浴30 min且以50%硫酸溶液作為稀釋劑的條件下，實驗得到最優水平，隨后分別按國標方法與優化方法繪制高級醇標準曲線，結果見圖6。由圖6可知，在0～40 mg/L質量濃度范圍內，吸光度值與高級醇質量濃度均呈具有良好的線性關系。

隨機抽取一酒樣，利用國標方法和優化方法將其平行檢測5次，精密度試驗結果以及回收率試驗結果分別見表1和表2。結果表明，國標方法檢測的高級醇含量的標準偏差為32.297，相對標準偏差為6.052%，而優化方法檢測的高級醇含量的標準偏差僅為7.008，相對標準偏差為1.665%，這表明優化后的方法精密度更好，測量結果更接近真實值。取同一酒樣1 mL于試管，加入100 mg/L的高級醇標準使用液10 μL，后分別采用國標法和優化法平行檢測6次并計算樣品加標回收率，結果兩種方法的加標回收率均＞95%，說明實驗方法準確可行。其中優化方法加標回收率為99.11%，高于國標方法的加標回收率（96.930%），進一步說明優化方法檢測高級醇時準確度更高，數據更可靠。

圖6 國標法與優化法標準曲線比較Fig.6 Comparison of standard curves between national standard method and optimized method

表1 國標方法與優化比色方法的精密度比較Table 1 Comparison of precision between national standard method and optimized method

表2 國標方法與優化比色方法的回收率比較Table 2 Comparison of recovery rate between national standard method and optimized method

2.2 優化比色法與國標法檢測高級醇含量對比

通過優化比色法對實驗室保存的50株釀酒酵母模擬發酵液中的高級醇含量進行初篩，后結合發酵特性篩選6株本土釀酒酵母，以商業酵母CECA為對照（CK），利用GC-MS法對7株釀酒酵母的高級醇產量進行了檢測分析，結果見表3。由表3可知，優化比色法所測結果與GC-MS法所測結果之間在統計學上沒有顯著差異（P＜0.05），從而證明優化比色法檢測更準確、穩定，可應用于實踐。

以商業酵母CECA為對照（CK），利用GC-MS法測定6株本土釀酒酵母發酵液中的高級醇，結果見圖7。由圖7可知，且異戊醇、異丁醇、苯乙醇為本土酵母中的主要高級醇類，正辛醇、正丁醇、異辛醇、正庚醇、正己醇、正戊醇6種醇的含量較低，僅占到高級醇總量的0.74%～2.22%。通過進一步分析發現，相對于CK和菌株LE25來說，其他菌株高級醇總量的降低主要是由于異丁醇和異戊醇產量的顯著降低，而菌株間苯乙醇含量差異的影響對導致醇類總量差異貢獻較小。與菌株LE25相比，菌株LP29和LP25的異丁醇產量分別降低了約占85.76%和94.19%，異戊醇產量分別降低了43.85%和44.01%，該菌株可在進一步生產試驗中保證葡萄酒品質的基礎上為降醇提供應用。此外，每株低產菌中異戊醇生成量均高于異丁醇，而在CK及LE25中則相反，這也為后續利用基因工程對相關代謝通路進行差異性分析提供了思路。

表3 優化方法與GC-MS法所測7株釀酒酵母菌株高級醇產量比較Table 3 Comparison of higher alcohols content of 7 strains detected by optimized method and GC-MS method

圖7 酒樣中主要高級醇含量Fig.7 Contents of main higher alcohols in wine sample

3 結論

本研究對GB/T 5009.48—2003中比色法測定酒中高級醇含量的方法進行條件優化。優化后的分析步驟為：取1 mL梯度稀釋20倍的蒸餾酒樣于試管（置于冷水浴）中，將2 mL質量濃度為5 g/L的對二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液沿管壁緩緩加入，蓋塞使其沉至管底靜置1 min后，將各管同時搖勻置于80 ℃水浴鍋中水浴30 min，取出后迅速沖水冷卻，立即加入2 mL 50%硫酸溶液混勻，冷卻10 min后倒入1 cm比色皿中，在波長520 nm處測定吸光度值。優化后得到標準曲線回歸方程y=0.016 6x-0.018 2，相關系數R2=0.995，精密度試驗結果相對標準偏差為1.665%，加標回收率99.1%，較國標法的96.9%更接近100%，證明優化法標準曲線相關系數更高，樣品檢測的精密度較高，準確度更好。

利用優化比色法對6株本土釀酒酵母的高級醇產量進行了檢測分析，并利用GC-MS法進行對比驗證。一方面，發現兩種方法均可準確檢測葡萄酒中高級醇總量，且在評價酵母菌株產高級醇總量上無統計學差異，優化比色法在過程監控中相較于GC-MS法更加經濟、適用，可以完全滿足企業生產中葡萄酒高級醇檢測的需要；另一方面，篩選獲得2株極低產高級醇的本土釀酒酵母菌株LP29和LP25，這將為我國部分葡萄酒產區葡萄酒高級醇含量相對較高的問題提供解決方案。