拮抗大腸桿菌的海洋微生物的篩選與鑒定

王曉彤 ，金黎明*，俞 勇，宮小明，權(quán)春善，趙 晶，侯熙彥

（1.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605；2.中國(guó)極地研究中心，上海 200136；3.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 濰坊 261041）

大腸桿菌（Escherichia coli）是革蘭氏陰性菌，一般不致病，但其中一些血清型比較特殊的大腸桿菌對(duì)人與動(dòng)物具有致病性，這些大腸桿菌通常會(huì)攜帶一些毒力因子，通過釋放毒素或襲擊腸黏膜細(xì)胞等方式致病[1]。食物是大腸桿菌致病菌株的傳播方式之一，大腸桿菌常存在于蛋類、肉制品、乳類及其制品中。當(dāng)今社會(huì)，抗生素的濫用已經(jīng)威脅到人類安全，各種新型耐藥菌株的感染現(xiàn)象明顯增多，耐藥大腸桿菌的擴(kuò)散程度日益嚴(yán)峻，這些都嚴(yán)重威脅著人類食品安全[2-4]。

海洋微生物因其具有為了長(zhǎng)期適應(yīng)復(fù)雜的海洋環(huán)境而生存的耐高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)、耐高壓等特性，可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，已成為分離純化研究的熱點(diǎn)[5-9]。鄭虹等[10]從福清市江陰鎮(zhèn)近海海域篩選出1株海洋芽孢桿菌HY4，對(duì)枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、大腸桿菌等都具有較強(qiáng)的拮抗作用。

芽孢桿菌能夠產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有細(xì)菌素、表面活性素、芬枯草菌素、抗菌肽等，這些抗菌物質(zhì)一般具有廣譜的抑菌活性、性質(zhì)比較穩(wěn)定，使得芽孢桿菌成為當(dāng)今研究生防菌株的熱點(diǎn)之一[11-12]，高兆建等[13]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌L-13產(chǎn)生的抗菌肽在新鮮果蔬、肉制品的保藏過程中能起到短期防腐的效果。目前，芽孢桿菌作為一種綠色、高效的微生物菌種已被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[14]。

本研究從北冰洋沉積物樣品中篩選能夠有效抑制大腸桿菌的海洋微生物，通過對(duì)其菌株形態(tài)進(jìn)行觀察、分析其生理生化試驗(yàn)結(jié)果以及在分子生物學(xué)角度進(jìn)行分析，進(jìn)行分類鑒定，并進(jìn)行了拮抗8種病原微生物的抑菌譜研究。該研究為進(jìn)一步分離純化其具有的抗菌活性物質(zhì)，從中尋找具有較高生物活性且結(jié)構(gòu)新穎的抗菌藥物奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品：2014年北極科學(xué)考察隊(duì)采集的北冰洋沉積物樣品。

1.1.2 指示菌

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）：本學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 主要試劑

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑：生工生物股份有限公司；氯化鈉（分析純）、胰化蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)行公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂15 g，氯化鈉10 g，去離子水1 L，pH 7.0。培養(yǎng)海洋微生物的培養(yǎng)基用過膜陳海水配制。

營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，去離子水1 L，pH 7.4。

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基：腦心浸粉17.5 g（小牛腦浸粉12.5 g，牛心浸粉5.0 g），D-葡萄糖2.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鈉2.5 g，瓊脂15.0 g，，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.6。

以上培養(yǎng)基配制完均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3020高壓滅菌器：SANYO公司；JA2603B 電子精密天平：上海精科天美貿(mào)易有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇潔醫(yī)療器械有限公司；MO-2270M1海爾微波爐：海爾集團(tuán)；MT-180B恒溫培養(yǎng)箱：新苗醫(yī)療器械制造有限公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 海洋微生物的分離和純化

分離自北冰洋沉積物樣品中的菌株，采用涂布平板法[15]。取0.5 g沉積物樣品，放入9倍體積的陳海水，待樣品充分分散后靜置使雜質(zhì)沉淀。采用陳海水梯度稀釋樣品上清液，分別選取稀釋度為10-4～10-7的稀釋液50 μL涂布于LB海水固體培養(yǎng)基。28 ℃條件下培養(yǎng)。重復(fù)平板劃線既得到純化的單菌株，標(biāo)號(hào)并進(jìn)行保藏。

1.3.2 大腸桿菌拮抗菌株的初篩

初篩是采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行篩選的[15]。將大腸桿菌培養(yǎng)液以0.1%（V/V）的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，充分搖勻后倒平板，待凝固后，將得到的分離純化后的菌株劃線于培養(yǎng)基上，置于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，觀察是否有抑菌帶，即作為初篩菌株。

1.3.3 大腸桿菌拮抗菌株的復(fù)篩

參考張靜楠等[16]的方法，將上述初篩獲得的菌株按0.1%（V/V）的接種量接種于LB海水液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180r/min條件下培養(yǎng)3～4d，得到的發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液旋蒸濃縮，并經(jīng)0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜過濾，得到濃縮發(fā)酵液。

檢測(cè)濃縮發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，采用瓊脂擴(kuò)散法[16]。將大腸桿菌按0.1%（V/V）的量接種于LB培養(yǎng)基中，在凝固的平板中打9 mm的瓊脂圓孔，每孔中加入300 μL濃縮發(fā)酵液，用超純水作空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)12 h。量取抑菌圈直徑，平行實(shí)驗(yàn)3組。

1.3.4 菌株的鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，分析其生理生化結(jié)果。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)其進(jìn)行歸屬分類。菌體進(jìn)行固定、脫水、干燥后噴金進(jìn)行掃描電鏡觀察[19]。

分子生物學(xué)鑒定：菌株于28 ℃在LB海水培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d。用加熱法提取菌株脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）模板，分別取10 μmol/L的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'）對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系：總體積為50 μL。模板取1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，5 U/μL的rTaq酶0.25 μL，細(xì)菌通用引物27 F、1492R各取1 μL，10×Loading Buffer 4 μL，剩余加無(wú)菌雙蒸水41.75 μL。條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火50 ℃30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)以上條件30次；完成后72 ℃延伸10 min。于4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取比對(duì)后菌株的16S rDNA序列，結(jié)合MEGA 6.0軟件描繪菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)其進(jìn)行歸屬分類[20]。

1.3.5 抑菌譜的測(cè)定

制備濃縮發(fā)酵液方法同1.3.3。

采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)濃縮發(fā)酵液對(duì)8種病原微生物的抑菌活性。其中特殊的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、屎腸球菌分別用NB、BHI、MRS培養(yǎng)基；其余均用LB培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基中接入100 μL病原微生物，混勻后倒平板，待平板凝固后打孔，孔中加入300 μL粗發(fā)酵液，37 ℃培養(yǎng)12 h，量取抑菌圈直徑。平行實(shí)驗(yàn)3組。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋微生物的分離結(jié)果

通過平板劃線法篩得97個(gè)單菌落，根據(jù)形態(tài)觀察，其中細(xì)菌偏多，分離得真菌8株。

2.2 大腸桿菌拮抗菌篩選結(jié)果

經(jīng)對(duì)峙培養(yǎng)，篩選出21株對(duì)白色念珠菌有明顯抑制性的菌株。采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩，抑菌效果見圖1。

圖1 105號(hào)菌株發(fā)酵液抑制大腸桿菌效果Fig.1 Effect of strain NO.105 fermentation liquid against Escherichia coli

由圖1可知，105號(hào)菌株的抑菌圈最大，抑菌圈直徑達(dá)（19.3±1.0）mm。

2.3 菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

圖2 105號(hào)菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 Morphological identification results of strain NO.105

由圖2可知，105號(hào)菌株在LB培養(yǎng)基上為不透明菌落，顏色呈黃白色，邊緣不整齊，有褶皺，鏡檢觀察為革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢。

2.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果

表1 105號(hào)菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical identification of strain NO.105

由表1可知，105號(hào)菌株檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性；吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)和尿素實(shí)驗(yàn)均呈陰性。根據(jù)比對(duì)初步判定菌株屬芽孢桿菌屬（Bacillus）。

2.3.3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖3 基于16S rDNA序列105號(hào)菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of PCR amplification products strain NO.105 based on 16S rDNA sequence

由圖3可知，105號(hào)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus atrophaeus聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株105為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。

2.4 抑菌譜測(cè)定結(jié)果

抑菌譜測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 105號(hào)菌株的抑菌譜Table 2 Antimicrobial spectrum of strain NO.105

由表2可知，105號(hào)菌株對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌的抑菌圈直徑分別為（19.0±1.0）mm、（17.8±0.2）mm、（15.5±0.4）mm、（19.4±0.7）mm均有不同程度的抑制作用，抑菌譜廣泛；但對(duì)副溶血弧菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌無(wú)抑制作用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從北冰洋沉積物中分離并篩選出對(duì)大腸桿菌具有良好拮抗作用的菌株。分離得97株菌株，21株菌株對(duì)大腸桿菌有一定的拮抗作用，且1株菌株拮抗效果最好，編號(hào)為105號(hào)，其抑菌圈直徑為（19.3±1.0）mm。進(jìn)而將該菌株通過16S rDNA測(cè)序鑒定，結(jié)合菌株系統(tǒng)發(fā)育樹證明該菌株為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。其對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌等均有不同程度的抑制作用，抑菌譜廣泛。

近年來，從天然資源中開發(fā)新型有效化合物已成為研究的趨勢(shì)，海洋微生物特殊的生存環(huán)境，有可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中篩選出的105號(hào)菌株，來源于特殊的生存環(huán)境——北冰洋，后續(xù)研究正在進(jìn)行中。