一株耐高溫解磷真菌溶磷條件的優化

張芮瑞，邱樹毅，周少奇，王雪酈，3

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州科學院，貴州 貴陽 550001；3.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

磷是除氮外限制植物生長的第二營養元素，在光合作用等過程中起著至關重要的作用[1-2]。由于土壤中有效磷的缺乏，速效磷肥被大量使用，而絕大部分的磷肥進入土壤后與Ca2+等金屬離子結合形成Ca3（PO4）2等難溶性磷，難以被植物吸收利用[3-4]。既造成有限磷礦資源大量浪費，還加劇農業資源污染問題[5]。好氧堆肥法能在一定程度上緩解肥料緊缺和環境污染方面的壓力，而解磷微生物菌劑的加入，不但可以加快肥料的腐熟，還可以促進磷素的轉化，提高肥效[6]。

目前，大量的解磷微生物相關的研究成果已被先后報道，解磷細菌主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和洋蔥伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）等[7-11]；解磷真菌主要為青霉屬（Penicillium）、根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）等[12-15]。實際上，解磷微生物的溶磷過程極其復雜，并非其中單一的某一因素起所有作用，而是多種因素共同作用的結果[16]。有關解磷微生物溶磷培養條件的優化早有研究[10，15]，獲得了大量研究成果。除簡單的單因素優化的研究外，也有采用正交法或者響應面法等進行進一步優化實驗的相關研究，從而盡多的探究更多因素對解磷微生物解磷條件的影響[17-18]。但上述所涉及的研究內容基本為非高溫解磷微生物，并不適用于好氧堆肥下的高溫條件。目前國內外對于耐高溫解磷微生物的研究相對較少，其中對耐高溫解磷真菌的研究更為稀缺。

本實驗早期篩選獲得的溶磷效果較好的耐高溫解磷真菌菌株GDF1，通過單因素試驗及響應面試驗，調整碳源、氮源等培養條件，探究解磷菌株解磷效果最佳時的溶磷條件，以期為GDF1菌株投入高效微生物菌肥的生產提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

耐高溫解磷真菌GDF1為本實驗室從白酒丟糟高溫堆肥樣品中篩選獲得。

1.1.2 培養基

無機磷發酵液體培養基：葡萄糖10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g；蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。其中Ca3（PO4）2需與其他藥品分開滅菌后再混合。

馬鈴薯葡萄糖固體培養基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂14 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.8～6.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

JJ-CJ-IFD型超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；THZ-82數顯恒溫氣浴振蕩器：天津賽得里斯實驗分析儀器制造廠；101-1AB電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；SpectraMax190酶標儀：美谷分子儀器有限公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋、BMJ-250C培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA-2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 解磷能力測定

將充分活化后的出發菌株GDF1接種于PDA培養基上，置于37 ℃培養數天至菌落布滿整個平板，加無菌水洗脫并用脫脂棉過濾，制備孢子懸浮液，經鏡檢孢子量約為1×107CFU/mL。

將孢子懸浮液以1%接種量接入無機磷液體培養基中，并以1%無菌水代替1%孢子懸浮液作空白對照，重復3次，作為平行。置于50 ℃、180 r/min恒溫振蕩器中培養5 d后取出，10 000 r/min條件下離心5 min，上清液經0.45 μm 濾膜過濾后采用鉬銻抗比色法[16]測定發酵上清液中的磷含量。以波長700 nm處測定吸光度值（OD700nm值）（y）為縱坐標，溶磷量（x）為橫坐標繪制磷標準曲線，得到鉬銻抗磷標準曲線線性回歸方程為y=0.300 5x+3×10-6，相關系數R2=0.999 8，通過磷標準曲線回歸方程計算溶液中有效磷含量，以確定菌株的解磷能力。

1.3.2 解磷條件優化

（1）碳氮源種類的優化

碳源種類的優化：分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖及甘露醇為唯一碳源（10.0 g/L），其他培養基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同碳源種類對其解磷能力的影響。

氮源種類的優化：分別以硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、乙酸銨及氯化銨為唯一氮源（0.5 g/L），其他培養基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同氮源種類對其解磷能力的影響。

（2）碳氮源、無機鹽及磷源濃度的優化

碳源濃度的優化：以最優種類碳源為唯一碳源，質量濃度分別為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，其他培養基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同碳源濃度對其解磷能力的影響。

氮源濃度的優化：以最優種類氮源為唯一氮源，質量濃度分別為0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，其他培養基成分不變，進行解磷能力的測定，研究不同氮源濃度對其解磷能力的影響。

無機鹽濃度的優化：以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O為無機鹽組合，總質量濃度分別為0.48 g/L、0.96 g/L、1.44 g/L、1.92 g/L、2.40 g/L，其他培養基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同無機鹽濃度對其解磷能力的影響。

磷源濃度的優化：以磷酸三鈣（Ca3（PO4）2）為唯一磷源，質量濃度分別為2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L，其他培養基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同磷源濃度對其解磷能力的影響。

（3）響應面法優化

根據單因素試驗結果，選取碳源質量濃度（A）、草酸銨質量濃度（B）、無機鹽濃度（C）及磷酸三鈣質量濃度（D）為自變量，以GDF1的溶磷量為響應值，對其解磷條件進行優化，利用各因素兩兩交互響應面、等高線以及響應面回歸模型進行優化，找出GDF1出現最大溶磷量所對應各因素的最優值，并進行驗證試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 溶磷條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for phosphorus-solubilizing conditions optimization

2 結果與分析

2.1 碳氮源種類的優化

分別以10 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖及甘露醇作為碳源進行液體發酵培養基最適碳源種類的篩選。試驗結果表明，不同碳源對菌株GDF1溶解磷酸三鈣的能力有差異，溶液中有效磷含量大小依次為蔗糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞甘露醇＞果糖＞乳糖，GDF1利用蔗糖作為碳源表現出更好的解磷能力，溶磷量為221.76 mg/L。

圖1 碳源（a）和氮源（b）種類對菌株GDF1溶磷能力的影響Fig.1 Effect of carbon source (a) and nitrogen source (b) type on the phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1

分別以0.5 g/L硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、乙酸銨及氯化銨作為氮源進行液體發酵培養基最適氮源種類的篩選。試驗結果表明，不同氮源對菌株GDF1溶解磷酸三鈣的能力有差異，溶液中有效磷含量大小依次為草酸銨＞硫酸銨＞氯化銨＞硝酸鈉＞乙酸銨＞硝酸銨，GDF1利用草酸銨作為碳源表現出更好的解磷能力，溶磷量為227.46 mg/L。

由以上試驗結果可得，GDF1的解磷培養基中最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為草酸銨。

2.2 碳氮源、無機鹽及磷源濃度的優化

以蔗糖為唯一碳源，培養基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結果表明，隨著蔗糖質量濃度增加，溶磷量呈現先增加后降低的趨勢，當其質量濃度達到10 g/L時，溶磷量最高，為228.33 mg/L。該結果趨勢與前人研究結果類似[19-20]，即不同的解磷微生物各自存在一個最適碳源濃度，在低于該值的范圍內解磷微生物的解磷能力會隨著碳源濃度的增加而增大，而一旦超過這個值，解磷微生物的解磷能力就會開始逐漸下降。

圖2 蔗糖（a）、草酸銨（b）、無機鹽（c）及磷酸三鈣（d）質量濃度對菌株GDF1溶磷能力的影響Fig.2 Effect of sucrose (a),ammonium oxalate (b),inorganic salt (c)and tricalcium phosphate (d) concentration on phosphorussolubilizing ability of strain GDF1

以草酸銨為唯一氮源，培養基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結果表明，隨著草酸銨濃度增加，溶磷量呈現先增加后降低的趨勢，當其質量濃度達到0.5 g/L時，溶磷量最高，為227.83 mg/L。氮源作為培養基組成的重要成分，在合適的濃度下，能促進解磷微生物的繁殖生長，從而加快磷轉化的進程，發酵液中的溶磷量隨之上升，但濃度過高時可能培養到后期會影響培養基的pH值，從而對微生物生長產生不利影響，而導致發酵液中的溶磷量下降。

以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O為無機鹽組合，培養基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結果表明，隨著無機鹽質量濃度增加，溶磷量呈現先增加后降低的趨勢，當其質量濃度達到0.96 g/L時，溶磷量最高，為228.32 mg/L。這種趨勢的出現推測可能與解磷微生物溶磷機制中的金屬離子的螯合作用機制有關。

以磷酸三鈣為唯一磷源，培養基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結果表明，隨著磷酸三鈣質量濃度增加，溶磷量呈現先增加后降低的趨勢，當其質量濃度達到10.0g/L時，溶磷量最高，為237.81 mg/L。該趨勢可能是由于當難溶性磷濃度低的時候，菌株GDF1可以利用轉化的磷原料少，所以發酵液中的溶磷量較少；隨著磷酸三鈣的增加GDF1可轉化的難溶性磷原料增加，發酵液中的溶磷量也隨之增加并達到最大值；而當磷酸三鈣濃度過高的時候，可能會對GDF1的生長繁殖有抑制作用，從而導致發酵液中的溶磷量下降。

2.3 響應面法優化結果與分析

2.3.1 響應面試驗結果

運用根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，通過蔗糖質量濃度（A）、草酸銨質量濃度（B）、無機鹽質量濃度（C）和磷酸三鈣質量濃度（D）進行4因素3水平的響應面分析試驗。以溶磷量（R）為響應值，響應面試驗設計與結果見表2。

表2 溶磷條件優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for phosphorus-solubilizing conditions optimization

續表

2.3.2 響應面試驗結果及方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行分析，以R為溶磷量，A、B、C和D分別對應蔗糖、草酸銨、無機鹽和磷酸三鈣的編碼。得到二次多項回歸方程：

對于上述回歸模型進行方差分析，并對模型系數進行顯著性檢驗，結果見表3。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

由表3方差分析結果可知，模型的F=95.03，P＜0.000 1差異極顯著，并且失擬項P=0.672 5＞0.05，故說明該模型是顯著的。模型的決定系數R2=0.989 6，說明擬合程度很好，且調整決定系數R2adj=0.979 2，預測決定系數R2pre=0.955 1，方差相差很小，說明可信度高，可以用此模型來分析和預測溶磷量最優提取工藝。蔗糖、草酸銨和磷酸三鈣對溶磷量影響均顯著（P＜0.05），無機鹽對溶磷量影響不顯著（P＞0.05）；因素對溶磷量影響程度為D＞B＞A＞C。對于交互作用來說，蔗糖和草酸銨、蔗糖和磷酸三鈣、草酸銨和磷酸三鈣以及無機鹽和磷酸三鈣交互作用對溶磷量的影響顯著（P＜0.05），蔗糖和無機鹽以及草酸銨和無機鹽交互作用對溶磷量的影響不顯著（P＞0.05），對于模型的二次項來說均極顯著。

2.3.3 響應面結果及分析

響應面優化模型各因素（蔗糖、草酸銨、無機鹽和磷酸三鈣）兩兩交互作用對溶磷量影響的響應面和等高線見圖3。

圖3 各因素交互作用對菌株GDF1溶磷能力影響的響應曲面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1

由圖3分析可知，蔗糖和草酸銨交互作用對溶磷量影響的等高線圖為橢圓形，說明蔗糖和草酸銨交互作用對溶磷量影響的顯著。當草酸銨不變時，隨著蔗糖的增加，溶磷量呈現先上升后下降的趨勢；同樣，當蔗糖不變時，隨著草酸銨增加，溶磷量也呈現先增加后減小的趨勢。蔗糖和無機鹽以及草酸銨和無機鹽交互作用對溶磷量的影響的等高線圖都接近圓形，說明對結果的影響不顯著（P＞0.05）。蔗糖和磷酸三鈣間交互作用對溶磷量的影響的等高線圖為橢圓形，且由圖3可以看出，結果隨著因素的改變的變化明顯，說明此因素交互作用對結果的影響顯著。草酸銨和磷酸三鈣以及無機鹽和磷酸三鈣交互作用對溶磷量的影響的等高線圖為較扁的橢圓形，說明對溶磷量的影響較為顯著，隨著因素的增加，溶磷量先增加，達到最大值后出現下降。

響應面圖均為開口向下的凸面，故響應值R存在極大值，為進一步優化結果，根據Design-Expert 8.0.6軟件得出在蔗糖、草酸銨、無機鹽和磷酸三鈣交互影響下，最優提取工藝為：蔗糖為10.65 g/L，草酸銨為0.61 g/L，無機鹽為1.02 g/L，磷酸三鈣為10.70 g/L。在此條件下模型預測的溶磷量為291.35 mg/L。

2.3.4 驗證試驗

為了方便實際操作，修改溶磷條件為蔗糖10.7 g/L，草酸銨0.6 g/L，無機鹽1.0 g/L，磷酸三鈣10.7 g/L。在此條件下進行驗證測試，經過3輪重復驗證，驗證組中測得的溶解磷量實際值為292.59 mg/L，與預測值291.35 mg/L接近，該結果說明此模型具有較好的可信度，可用于后續研究。

3 結論

研究結果表明不同種類的碳源和氮源會影響菌株GDF1的溶磷效果，通過單因素試驗設計及響應面試驗先后對菌株GDF1 的溶磷條件進行了優化。結果顯示，耐高溫菌株GDF1的最佳解磷條件為：蔗糖10.7 g/L，草酸銨0.6 g/L，無機鹽1.0 g/L，磷酸三鈣10.7 g/L。在此優化條件下，實際驗證溶磷量為292.59 mg/L。本試驗中的菌株GDF1是耐高溫解磷真菌，經優化后，在耐高溫解磷微生物中解磷性能表現良好，可作為耐高溫微生物制劑的潛在原料，為推動耐高溫解磷微生物的應用提供理論基礎和技術支撐。