蒼白桿菌產生物表面活性劑的提取研究

劉 玲，孫玉梅

（大連工業大學生物工程學院，遼寧大連 116034）

生物表面活性劑是微生物通過發酵產生的表面活性化合物，其生產菌株主要為細菌、真菌和酵母菌，研究較多的有假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、不動桿菌屬（Acinetobacterspp.）、紅球菌屬（Rhodococ cusspp.）等，而有關蒼白桿菌屬（Ochrobactrumspp.）的研究較少。生物表面活性劑按結構可大致分為糖脂、脂肽或脂蛋白、磷脂及中性脂衍生物等[1]。與化學表面活性劑相比，生物表面活性劑具有環境友好性和可生物降解性等優點，但其實際生產受諸多因素的影響，其中最為突出的是生產成本高。目前，已有大量研究對生物表面活性劑的上游發酵過程進行了優化[2]，但對下游加工過程進行優化的研究卻很少，并且下游加工成本約占總生產成本的60%～80%[3]，因此生物表面活性劑的下游加工尤為重要。下游加工面臨的主要難題包括培養基、產物及其同系物的復雜性，不同培養基和產物的熱穩定性未知或不明確以及發酵液中產物濃度低等[4]。

目前從發酵液中提取生物表面活性劑的方法有很多，如酸沉法、溶劑萃取法、有機溶劑沉淀法、超濾法、泡沫分餾法、吸附法和色譜法等，但并不具有一定的規律，必須由產物的性質而定[5]。在這些方法中最常用的為前三種，并且酸沉法與溶劑萃取法通常結合使用。將酸沉法與氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）萃取[6]、無水乙醚萃取[7]以及乙酸乙酯萃取[8]結合均可用于脂肽類生物表面活性劑的提取。將酸沉法與乙酸乙酯萃取法結合，還可用來提取糖脂類生物表面活性劑[9]及4-二甲基氨基苯甲醛（4-（dimethylamino）benzaldehyde）[10]。對于生物乳化劑的提取，較多的是采用有機溶劑沉淀法。ZARINVIARSAGH M等[11]采用冷乙醇沉淀法提取中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）MZV101所產生物乳化劑，提取率為49.32%，提取產物乳化活性可達70.99%，冷丙酮沉淀法提取產物的提取率和乳化活性分別為38.21%和62.87%，硫酸銨提取效果略低于冷丙酮，而異丙醇無提取效果。于人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）MP3的發酵液中加入3倍體積冷乙醇，能提取得到對柴油、煤油和葵花油都有良好乳化活性的產物[12]。于不動桿菌（Acinetobacter）發酵液中加入3倍體積冷乙醇進行提取，亦可得到具有良好乳化活性的生物乳化劑[13]。

本研究采用了調pH法、溶劑萃取法和沉淀法對蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）所產生物表面活性劑進行提取，從提取效率和產物活性兩方面對提取效果進行評估，并研究調pH法與乙醇沉淀法結合對生物表面活性劑提取效果的影響，為進一步提高分離效果和產物純度奠定基礎和提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）：由大連工業大學生物催化技術國家與地方聯合工程實驗室分離、鑒定并在20%甘油管中于-80 ℃保存。

1.1.2 化學試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術責任有限公司；NaCl、蔗糖、硝酸鈉、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、無水乙醚、丙酮、體積分數95%的乙醇、液體石蠟（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；F254硅膠板：德國Merck公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基：NaCl 15 g/L，牛肉膏5 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，調pH 至7.0，115 ℃濕熱滅菌30 min。

種子及發酵培養基：蔗糖10 g/L，硝酸鈉4 g/L，KH2PO43.4 g/L，Na2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母浸粉0.2 g/L，調pH至7.0，115 ℃濕熱滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型精密pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-5200型分光光度計：上海元析儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；LYO QUEST-85真空冷凍干燥儀：西班牙Telstar公司；H1750R離心機：湘儀離心機儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：金壇市金城翔龍儀器廠；DNP-9082型恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；ZWY-C211D型臥式旋轉式恒溫恒濕搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液及發酵液的制備

取一環-80 ℃甘油管中保存的蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）涂布于新鮮斜面上，30 ℃靜置培養48 h后取一環菌涂布于另一新鮮斜面上，30 ℃靜置培養48 h得到活化菌種。取2環活化菌種接入種子培養基中，30 ℃、160 r/min培養48 h得到種子液。以8%接種量將種子液接入發酵培養基中，30 ℃、160 r/min培養5 d得到發酵液。

1.3.2 不同方法對生物表面活性劑的提取

將發酵液離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），得到發酵上清液，并對發酵上清液分別采用調pH法、有機溶劑萃取法、有機溶劑沉淀法及調pH法結合乙醇沉淀法進行生物表面活性劑的提取。

調pH法：用6 mol/L HCl和6 mol/L NaOH將發酵上清液的pH分別調至1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、13.0、14.0，4 ℃靜置14 h，離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），分離上清液和沉淀，沉淀冷凍干燥后稱質量，將干燥的沉淀重溶于原始發酵液1/5體積的去離子水中進行乳化活性測定。

有機溶劑萃取法：向發酵上清液中分別加入2倍體積的氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）、乙酸乙酯和乙醚進行萃取，分離有機相和水相，測定水相的乳化活性及成分組成。

有機溶劑沉淀法：向發酵上清液中分別加入2倍體積的冷丙酮、冷乙醇和冷甲醇（-20 ℃過夜預冷），4 ℃靜置14 h。離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），沉淀揮發除去有機溶劑后冷凍干燥，稱質量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成。

調pH法結合乙醇沉淀法：將發酵原液、調發酵液pH至13除去沉淀溶液、調發酵液pH至13除去沉淀后，上清液調至原始pH溶液作為樣液，分別向上述3種不同處理樣液中加入2倍和3倍體積的冷乙醇，500 r/min冰浴攪拌10 min，于4 ℃靜置沉淀14 h后，離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），沉淀揮發除去乙醇后冷凍干燥，稱質量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成。

1.3.3 分析檢測

乳化活性：取1.5 mL樣品，加入0.9 g液體石蠟，手動搖勻150次，靜置24 h，乳化層高度占總液層高度的百分比即為乳化活性；采用3,5-二硝基水楊酸法[14]測定水解后樣品中的總糖含量；采用國標GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》[15]測定樣品中的脂肪酸含量；采用考馬斯亮藍法[16]測定樣品中的蛋白含量；采用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法[17]測定生物表面活性劑的組成成分。

2 結果與分析

2.1 調pH法對生物表面活性劑的提取

將發酵液pH值調至1～14，發現pH值1～12均無沉淀產生，而在pH值為13和pH值為14產生少量沉淀，將沉淀溶解于原提取發酵液1/5體積的去離子水中，對其進行分析檢測，結果見表1。

由表1可知，沉淀主要成分為糖、脂肪酸和磷酸鹽及少量蛋白質，將沉淀溶解于原提取發酵液1/5體積的去離子水中，pH值為13沉淀（pH值為13時所產沉淀溶解于原提取發酵液1/5體積的去離子水中后，溶液中沉淀的質量濃度1.83 g/L）無乳化活性，pH值為14沉淀（pH值為14時所產沉淀溶解于原提取發酵液1/5體積的去離子水中后，溶液中沉淀的質量濃度1.40 g/L）表現出較小的乳化活性。

表1 發酵液在pH 13和pH 14所產沉淀的量、乳化活性和組成Table 1 Amount,emulsifying activity and composition of precipitate produced in fermentation broth at pH 13 and pH 14

將發酵上清液調pH 2進行酸沉淀是生物表面活性劑最常用的提取方法，但在本研究中發酵液pH值調至1～2時均無沉淀產生，調至pH 13以上所產沉淀乳化活性也較低，因此通過調pH法不能用于提取該生物表面活性劑。有文獻報道，將發酵液pH調至2有沉淀產生的為脂肽或脂蛋白類表面活性劑，無沉淀的則為糖脂類表面活性劑[18-19]，由此初步推測該菌株所產物質可能為糖脂類生物表面活性劑。

2.2 有機溶劑萃取法對生物表面活性劑的提取

有機溶劑萃取法是生物表面活性劑提取的常用方法，常用的溶劑有氯仿、甲醇、乙醚、乙酸乙酯等，其中氯仿和甲醇通常以不同比例混合使用[5]。發酵液通過乙酸乙酯、無水乙醚及氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）萃取后，測定水相的乳化活性及成分組成，結果見表2。

由表2可知，通過乙酸乙酯、無水乙醚及氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）萃取后，水相中糖、脂肪酸、蛋白質和磷酸鹽殘留均很大，且水相中乳化活性仍然較高，說明這幾種溶劑不能有效地萃取出生物乳化劑。這幾種方法中，乙酸乙酯對總糖的提取率較高，氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）對蛋白質的提取率較高，無水乙醚對脂肪酸的提取率更高，三種方法對磷酸鹽提取率幾乎相同。

表2 有機溶劑萃取后水相的乳化活性及組成Table 2 Emulsifying activity and composition of aqueous phase after organic solvent extraction

2.3 有機溶劑沉淀法對生物表面活性劑的提取

有機溶劑主要通過降低溶液的介電常數以及破壞分子表面水化層來實現產物的沉淀分離[20]。向發酵上清液中分別加入2倍體積的冷丙酮、冷乙醇和冷甲醇（-20 ℃過夜預冷），4 ℃靜置14 h，沉淀揮發除去有機溶劑后冷凍干燥，稱質量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成，結果見表3。

由表3可知，向發酵液中加入2倍體積冷甲醇沒有沉淀產生，而加入冷乙醇和冷丙酮有沉淀產生，且丙酮沉淀量略高于乙醇沉淀量。產生這種差異的原因應該與三者的介電常數有關，三者的介電常數[20]分別為33、24、22，在加入量相同的情況下，溶劑介電常數越低則理論上能使更多的物質沉淀下來。乙醇沉淀量雖略低于丙酮沉淀量，但其乳化活性高于丙酮沉淀，且與原始發酵液乳化活性相近。且兩者沉淀下來的物質有所不同，乙醇沉淀中總糖和磷酸鹽含量較高，而丙酮沉淀中蛋白質和脂肪酸的含量較高。鑒于乙醇沉淀的乳化活性（57.31%）及丙酮的毒性，進一步研究采用乙醇沉淀法對生物表面活性劑進行提取。

表3 加入有機溶劑產生沉淀的量、乳化活性和組成Table 3 Amount,emulsifying activity and composition of precipitation produced by adding organic solvents

2.4 調pH法結合乙醇沉淀法對生物表面活性劑的提取

分別向不同處理樣液中加入2倍和3倍體積的冷乙醇，500 r/min冰浴攪拌10 min，于4 ℃靜置沉淀14 h后，沉淀揮發除去乙醇后冷凍干燥，稱質量并用去離子水溶解至原體積，測定乳化活性及成分組成，結果見表4。

由表4可知，采用不同方法提取后所得沉淀均含有少量糖、蛋白質、脂肪酸及大量磷酸鹽。采用將發酵液pH調至13除沉淀后再乙醇沉淀，沉淀量顯著高于其他兩種處理方式（P＜0.05）。加入2倍體積冷乙醇時，沉淀量（6.33 g/L）較其余兩種處理方式沉淀量（4.26 g/L、4.74 g/L）分別提高了48.59%和33.54%；加入3倍體積冷乙醇時沉淀量（6.69 g/L）較其余兩種處理方式（4.61 g/L、4.89 g/L）分別提高了45.12%和36.79%。三種處理中加入3倍體積冷乙醇較加入2倍體積冷乙醇的沉淀量分別增加了8.22%、5.69%和3.16%。由此可見，發酵液的pH比乙醇用量對沉淀效果的影響更大。并且在沉淀質量濃度均為3 g/L時，采用后兩種處理方式并加入3倍體積冷乙醇，沉淀乳化活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05），其值分別為60.00%和59.63%，較直接向原始發酵液中加入3倍體積冷乙醇進行提取相比提取分別提高了50.00%和49.08%。由此推測，在將發酵液pH調至13的過程中改變了體系中某些物質的溶解性，使得更多的物質沉淀了下來。將發酵液pH值調至13后加入3倍體積冷乙醇進行提取，不僅沉淀量多，而且單位質量沉淀的乳化活性也較高，因此認為此方法更適合該生物表面活性劑的提取，經測定所得沉淀中含有少量糖、蛋白質、脂肪酸以及較多的磷酸鹽，幾種組分的提取率分別為50.29%、80.62%、34.43%和70.42%。

表4 發酵液調pH結合乙醇沉淀的產量、乳化活性和組成Table 4 Amount,emulsifying activity and composition of precipitate by adjusting pH combined with ethanol precipitation of fermentation broth

2.5 生物表面活性劑的組分分析

采用不同方法提取蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）發酵液生物表面活性劑，并用TLC法測定生物表面活性劑的組成成分，以正丁醇∶乙醇∶水（5∶3∶2，V/V）為展開劑，苯胺-二苯胺-磷酸溶液用于糖顯色，羅丹明用于脂顯色，茚三酮用于蛋白顯色，85 ℃烘烤10 min進行顯色，并以培養基中的蔗糖和酵母浸粉以及發酵液作為標品，結果見圖1。

圖1 不同方法提取的產物薄層層析Fig.1 Thin layer chromatography of products extracted by different methods

由圖1可知，采用不同方法對發酵液進行提取，所得產物均無與蔗糖和酵母浸粉相同的條帶，說明得到的產物不是培養基中殘留的蔗糖和酵母浸粉；發酵液和所有方法提取得到的產物均在基線處有糖和脂肪酸的顯色，說明提取所得產物分子質量可能較大，導致在此展開條件下比移值較低；并且顯色深淺不同，說明不同方法提取得到的產物濃度不同，顯色較深的有發酵液調pH 13除沉淀后加入3倍體積乙醇，以及發酵液調pH 13除沉淀后回調至原始pH，再分別加入2倍和3倍體積乙醇所得沉淀，由此推測發酵液經不同處理后再乙醇沉淀提取所得產物均可能是分子質量較大的糖脂類生物表面活性劑，只是生物表面活性劑含量不同。文獻報道分子質量較大的生物表面活性劑通常具有乳化能力[21]，將發酵液pH調至2.0無沉淀產生的為糖脂類表面活性劑[18-19]，這也與該推測相符合，只是該產物中的糖和脂肪酸的含量都較低。不同方法提取后沉淀中生物表面活性劑含量差異應該與提取時的pH有關，表面活性劑是兩性物質，親水一端往往都是極性大的酸性或者堿性基團，pH的改變必將改變這兩類基團的狀態，從而改變分子正負電荷比例的狀態，引起親水親和力強度的改變。特別是當分子電荷密度升高，如pH 13時，成鹽形式的帶電荷羧酸根增多，極性增強，加入高濃度的乙醇與水分子混合時，降低了水溶液的極性，析出大量的強極性的兩性表面活性劑。

3 結論

經對比，調pH法、溶劑萃取法（無水乙醚、乙酸乙酯、氯仿/甲醇）、甲醇沉淀法及丙酮沉淀法均不能有效將該生物表面活性劑提取出來，而乙醇沉淀法可提取出乳化活性很高的生物表面活性劑。將發酵液pH值調至13除去沉淀后加入3倍體積冷乙醇提取產量（6.69 g/L）和乳化活性（60.00%）均最高，與直接對原始發酵液加入3倍體積冷乙醇進行提取相比，產量提高了45.12%，乳化活性提高了50.00%，該法可得到分子質量較大且含有少量糖、蛋白、脂和較多磷酸鹽的生物表面活性劑。研究發現，發酵液的pH比乙醇用量對提取效果影響更大，因此在后續的研究中可進一步探討將發酵液pH值調13除雜后回調至不同pH，再乙醇沉淀對沉淀效果的影響。本研究可為進一步提高分離效果和產物純度奠定基礎和提供依據，也可為不能采用酸沉法提取的生物表面活性劑的提取研究提供參考意見。