青春期前雙酚A暴露對雌性大鼠生殖器官發育的影響

張瑩瑩,劉天龍,佘銳萍,田紀景,隋海霞,高 芃,包匯慧

(1.中國農業大學動物醫學院,北京海淀100193 ；2. 國家食品安全風險評估中心國家衛生健康委員會食品安全風險評估重點實驗室,北京朝陽100021)

雙酚A(Bisphenol A,BPA)是一種重要的工業原料，廣泛應用于食品接觸材料的制造中。BPA是世界已知重要的環境雌激素之一，BPA的化學結構與乙烯雌酚類似，進入體內可模擬雌激素活性，對人體健康有一定風險，引起人們的普遍關注[1]。目前雖然有許多國家禁止BPA用于嬰兒奶瓶的生產，但在餐具、玩具及自來水管等材料中仍廣泛存在，國內外有大量文獻報道在大多數食品中都可檢出BPA，特別是動物性食品和罐裝食品中[2-3]。流行病學研究表明，BPA暴露人群非常廣泛，超過90%的個體尿中可檢測到BPA,6～11歲兒童尿中BPA濃度在各年齡組中最高[4]。兒童BPA暴露是一個值得關注的問題，處于發育期的兒童下丘腦-垂體-性腺軸尚未發育成熟，體內性激素水平比較低，此時機體對外源性雌激素反應更敏感，BPA在體內模擬雌激素與受體結合，干擾內分泌信號通路，從而引起生殖系統發育異常。這個時期的兒童可通過多種途徑暴露于BPA，特別是通過膳食和飲水暴露[5]，可能短期內大劑量或高濃度暴露于BPA，因此青春期前兒童BPA暴露是高危人群。目前關于BPA對生殖系統影響的研究主要集中在其雌激素效應方面，如對雌性實驗動物陰道開口時間、動情周期、子宮濕重等方面的影響[5]，但對青春期前暴露BPA的雌性生殖器官發育，特別是對青春期前的卵巢和子宮組織結構和形態功能方面的研究較少。本研究以青春期前雌性大鼠為動物模型，從毒性病理學角度觀察雙酚A短期大劑量暴露對子宮和卵巢形態結構及卵泡發育的影響，為進一步揭示BPA對生殖器官的作用機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 Tissue-TEK脫水機、包埋機、封片機，均購自日本櫻花公司；SHANDON病理切片機，購自英國SHANDON 公司；Leica全自動染色機、Leica光學顯微鏡及圖像采集系統，均購自德國Leica公司；Motic電子圖像采集模塊和圖像分析系統，購自邁克澳迪公司。

雙酚A(純度 99%，CAS NO.80-05-7)，購自百靈威；精制橄欖油溶劑(化學純)，購自國藥集團；BPA用無水乙醇配制成 5% 母液，經橄欖油稀釋后使用；雌激素(E2)ELISA檢測試劑盒，購自北京方程生物技術有限公司。

1.2 實驗動物 清潔級21日齡雌性Wistar 大鼠40只，體重 50～55 g,由北京維通利華有限公司提供(許可證號：11400700029782)，大鼠飼養于中國農業大學動物醫學院動物房(許可證號：SYXK-0001)。大鼠自由采食和飲水，室內溫度 20～25 ℃，濕度30%～70%，每天光照12 h。

1.3 試驗方法 適應性喂養1周后開始試驗。稱重后隨機將40只雌性Wistar大鼠分成4組，對照組給予溶劑橄欖油，BPA試驗組給予不同濃度的BPA工作液,由BPA母液溶于橄欖油配制，根據BPA觀察到不良作用的最低劑量[LOAEL,60 mg/(kg·bw)]，未觀察到不良作用水平[NOAEL,5 mg/(kg·bw)][6]及前期預試驗結果確定BPA試驗劑量，低、中、高劑量分別為20、60 mg/(kg·bw)和180 mg/(kg·bw)，每組10只大鼠。為減少灌胃引起的肝首過效應，提高BPA的生物利用率，明確劑量-反應關系，參照BPA生殖毒性研究BPA給予方式[6]，于大鼠28日齡開始腹腔注射，試驗期間根據體重調整BPA注射量，1次/d，連續7 d至青春期，每天稱重。給予BPA 7 d后稱重、麻醉后采血處死，迅速取出肝臟、脾臟、子宮和卵巢，稱重后用多聚甲醛-戊二醛固定液固定，計算肝臟、脾臟、子宮和卵巢的臟器指數(臟器指數= 臟器濕重(mg)/體重(g))。固定后的組織按常規石蠟切片方法制作4 μm 連續石蠟切片，常規H.E.染色后光鏡觀察。通過Motic 電子圖像采集模塊采集切片圖像，不同觀察視野下輸出的圖像經過處理后輸入計算機,利用圖像分析系統軟件,對觀察視野進行選取、圖像處理、圖像分析、測量等功能[7]。每只動物隨機選取5張卵巢及子宮切片，每張切片隨機選取10個視野，在光鏡200倍視野下計數卵巢中各級卵泡數量，利用Motic軟件測量子宮內膜厚度、子宮外腔直徑和子宮腔面積，利用Motic組織病理參數分析軟件對測量數據進行半定量分析。取平均值作為每只動物各級卵泡數量、子宮組織結構參數最終數據，用平均值±標準差表示，SPSS 22.0軟件進行單因子方差(One-way ANOVA)分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

采集的血液樣品于 4 ℃冰箱靜置 2 h 后，3 000 r/min 離心 20 min，分離后的血清采用ELISA方法進行血清雌二醇(E2)含量測定，具體按照試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 BPA對青春期前大鼠臟器指數及血清雌二醇的影響 BPA腹腔注射暴露7 d后各組大鼠子宮和卵巢指數以及血清雌二醇含量，見圖1和圖2。BPA試驗組大鼠子宮和卵巢臟器指數均呈升高趨勢，其中BPA 180 mg/(kg·bw)組大鼠子宮和卵巢臟器指數與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；BPA腹腔注射暴露7 d后,BPA試驗組血清雌二醇水平呈下降趨勢，其中BPA 180 mg/(kg·bw)組大鼠血清雌二醇與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 BPA對青春期前大鼠子宮組織結構的影響 如中插彩版圖3所示，光鏡觀察發現對照組大鼠子宮內膜為排列整齊的單層矮柱狀細胞，由內膜表面上皮細胞向固有層深陷形成的子宮腺較少，固有層結構致密，血管豐富； BPA試驗組大鼠子宮組織結構發生不同程度變化，主要表現為內膜不同程度增厚，內膜上皮細胞由單層矮柱狀上皮細胞變為高柱狀上皮細胞，內膜向固有層深陷形成大量皺襞，子宮腺體增多，固有層結構疏松，間質增寬。BPA 180 mg/(kg·bw)組大鼠子宮內膜顯著增厚、內膜上皮細胞為多層高柱狀、核深染，內膜下顆粒細胞增多，內膜向固有層深陷形成的子宮腺大量增加，功能層厚度增加，固有層基質細胞和血管減少，結構疏松，間質極度增寬。

利用Motic組織病理參數分析系統對各組大鼠的子宮內膜厚度、子宮外腔直徑及內腔面積進行測量分析。結果見表1，發現與對照組比較，BPA試驗組大鼠子宮內膜厚度、子宮外腔直徑和內腔面積均增高；BPA 180 mg/(kg·bw)組大鼠子宮內膜厚度和外腔直徑與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05), BPA 180 mg/(kg·bw)組大鼠子宮內腔面積與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 BPA對青春期前大鼠卵巢組織結構的影響 如中插彩版圖4所示，切片觀察發現對照組大鼠卵巢結構完整，皮質、髓質結構清晰；皮質內可見發育初期的卵泡，分布于皮質淺部的原始卵泡數量較多，皮質結締組織致密；髓質結締組織較疏松，髓質內可見少量血管。BPA試驗組與對照組比較，皮質淺部的原始卵泡隨劑量增加而數量減少，初級卵泡、次級卵泡數量增多；皮質、髓質結締組織疏松，血管擴張； BPA 180 mg/(kg·bw)組大鼠皮質淺部僅見個別原始卵泡，皮質和髓質內可見大量初級卵泡和次級卵泡，皮質和髓質結締組織疏松，血管擴張充血。

利用Motic組織病理參數分析系統對各組大鼠卵巢中初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡及卵泡總數進行半定量分析。結果見圖5，發現與對照組比較，BPA試驗組各級卵泡數量增加，其中BPA 60 mg/(kg·bw)組大鼠卵巢中初級卵泡及BPA 180 mg/(kg·bw)組大鼠卵巢中次級卵泡、卵泡總數顯著增多，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

雙酚A是在生活中經常接觸到的環境雌激素，經常作為食品和飲料包裝材料、金屬罐內涂層等食品接觸材料，進而由食物鏈進入生物體內并與雌激素受體相互作用，干擾正常激素在體內的產生、釋放、運輸、代謝等作用，從而影響生物的生殖功能[8]。研究表明，BPA對雄性小鼠生精細胞造成損傷、生殖細胞變性，BPA還可能通過破壞支持細胞骨架和改變支持細胞形態而損害雄性生殖功能[9]；BPA與17-β-雌二醇類似，誘導雄性產生卵黃蛋白原從而發揮雌激素作用[9]。BPA對雌性生殖系統的影響主要表現為動情周期不規律、性行為異常、卵巢萎縮、受孕率下降、生殖道發病率增加等[9]，BPA加了體內雌激素實際負荷量，加劇了子宮、卵巢、乳房等激素敏感器官病變的可能性，BPA可通過模擬雌激素作用,刺激子宮內膜上皮細胞和基質增生,增加子宮腺體數目，從而影響雌性生殖器官發育[10]；研究顯示，40.9% 的性早熟女童血清中檢測出BPA，而正常女童僅 2% 檢出，同時發現血清BPA含量與子宮體積、卵巢體積呈正相關[10]。雙酚A在成年生物肝臟代謝酶的催化下可生成水溶性的葡萄糖醛酸-雙酚A而失去生物學活性[11]，但是幼齡生物體內葡萄糖醛酸代謝酶系發育還不完善，因此幼齡生物暴露雙酚A后，血液中雙酚A的濃度高于成年生物，所以對幼齡生物BPA暴露的研究更具有現實意義[12]。

表1 BPA 暴露7 d青春期前大鼠子宮內膜厚度、外腔直徑及內腔面積的影響Tabel 1 Effects of 7-day BPA exposure on endometrial thickness, external cavity diameter,and internal cavity area in adolescent rats

劑量組Group子宮內膜厚度/μmEndometrial thickness子宮外腔直徑/μmExternal diameter of uterus子宮內腔面積/mm2Intrauterine cavity area0 mg/(kg·bw)234.77±24.58951.06±125.6569.46±15.4520 mg/(kg·bw)263.75±35.651 053.11±145.36118.86±25.4760 mg/(kg·bw)286.15±25.861 074.72±184.25118.35±25.14180 mg/(kg·bw)322.25±45.24?1 599.85±178.54?183.53±23.55??

本試驗從毒性病理學角度觀察BPA暴露對雌性生殖器官組織結構和形態的影響，結合血清雌激素水平和臨床指標，觀察BPA對幼年雌性生殖器官結構和形態功能影響機制。卵巢和子宮解剖結構、血清雌激素水平是雌性生殖發育的重要指標，子宮內膜厚度、子宮腔面積和外徑是衡量子宮發育的重要指標，各級卵泡數量是卵巢發育和功能的重要指征[13]。病理觀察結果發現，隨著BPA劑量的增加，青春期前大鼠子宮內膜厚度、子宮腺數量均呈上升趨勢，子宮內面積逐漸增大，子宮指數增加，表明青春期前短期暴露可以顯著促進雌性大鼠生殖器官發育，提示BPA暴露可能會使實驗動物青春期提前。王慧等[14]研究發現，BPA可使子宮系數增加，使子宮腺體及腺管結構發生改變，與本研究結果一致。另外，本試驗病理觀察發現，BPA短期暴露會引起青春期前大鼠卵巢指數升高，卵巢原始卵泡數量減少，其他各級卵泡數量增加，未觀察到明顯的卵泡閉鎖現象，提示BPA暴露可能會使雌性大鼠卵巢提前發育，而李昱辰等[15]研究發現，BPA能夠使未成年大鼠子宮濕重及臟器系數降低，卵巢原始/初級卵泡比例減少，閉鎖卵泡比例增加，這可能與實驗動物在青春期前、青春期BPA暴露及染毒劑量不同等因素有關。青春期前BPA暴露可能使大鼠提前進入青春期，但在青春期的BPA暴露，由于存在與內源性雌激素競爭受體結合，從而影響青春期雌激素對生殖器官發育的促進作用，從而呈現出假性成熟。

另外，本試驗發現青春期前大鼠BPA高劑量暴露可引起血清雌二醇水平顯著降低，這可能與外源性環境雌激素引起下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)的負反饋機制有關。一定濃度條件下,BPA與垂體和下丘腦的雌激素受體結合，從而阻止內源性雌二醇與受體結合，這種結合可能會替代雌二醇對垂體和下丘腦的反饋調節，引起雌激素介導的下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)和垂體促性腺激素的合成和改變，進而影響血清性激素水平[16]。Kovanecz等[17]

研究發現，長期給予大鼠低劑量的BPA體重雖然沒有變化，但血清雌激素水平下降。Ferguson等[17]研究認為，高劑量BPA可使大鼠HPG軸發育不全，導致生殖系統無法正常發育，促性腺激素合成下降。Heum等[18]認為，BPA通過雌激素樣效應干擾機體正常的青春期發育是由抑制下丘腦中雌激素活性，破壞GnRH脈沖發生器正常功能，從而使雌激素正常分泌受損。Brannick等[19]認為，BPA可能通過性腺、類固醇代謝、轉運蛋白或受體途徑干擾HPG負反饋機制，進而影響青春期發育。本研究觀察到的血清中雌激素水平下降與HPG負反饋機制的關系尚需進一步研究證實。