改進型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎動物模型的建立

劉家望,王宏偉,許江城,佘銳萍

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193 ; 2.北京韓美藥品有限公司,北京順義101312)

膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis, CIA)動物模型首先由Trentham等[1]于1977年在大鼠、隨后由Courtenay等[2]于1980年在小鼠中成功建立。該模型通過Ⅱ型膠原(Type II collagen, CII)免疫誘導(dǎo)動物產(chǎn)生自身免疫性關(guān)節(jié)炎。CIA的產(chǎn)生和發(fā)展依賴于自身T淋巴細胞和B淋巴細胞的激活[3]。CIA模型與人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)表現(xiàn)相似，是研究RA的較理想模型。但是該模型也有一些缺點，主要為造模時間長，發(fā)病率偏低，發(fā)病嚴重程度較低，動物個體間發(fā)病時間和炎癥嚴重程度差異較大等[4-5]。

圖5 抗CII/CD3雙抗處理后小鼠足爪病變
Fig.5 Paw change of the mice after anti-CII/CD3 bispecific antibody treatment
A：正常小鼠； B：抗CII/CD3雙抗處理后小鼠
A: Normal mice; B: Anti-CII/CD3 bispecific antibody-treated mice

雙特異抗體是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的熱點之一，它能同時與腫瘤細胞上的腫瘤相關(guān)抗原和免疫細胞表面分子(如T淋巴細胞上的CD3分子)結(jié)合，從而將T淋巴細胞募集到腫瘤細胞表面，然后通過靶細胞結(jié)合依賴的方式導(dǎo)致靜息T淋巴細胞活化、增殖，并且釋放促炎性細胞因子，從而更有效地殺傷腫瘤細胞[6-8]。

受此啟發(fā)，本試驗探索采用能同時與關(guān)節(jié)軟骨上的CII分子和T淋巴細胞上的CD3分子結(jié)合的抗CII/CD3雙特異抗體聯(lián)合膠原免疫，建立一個發(fā)病迅速、發(fā)病率高、炎癥嚴重程度較高且動物個體差異小的改進型RA實驗動物模型，為RA的發(fā)病機制研究和開發(fā)新的診斷、治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 DBA/1小鼠，雄性，8周齡， SPF(Specific pathogen free，無特定病原體)級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在北京韓美藥品有限公司動物房屏障環(huán)境內(nèi)[許可證號: SYXK(京) 2015-0013]。

1. 2 儀器和試劑 儀器: 離心機MULTIFUGE X3R (Thermo Fisher)，蛋白純化系統(tǒng)AKTA purifier 100(GE)。試劑: 牛CⅡ，小鼠CII和抗CII單抗(Chondrex)。抗小鼠CD3單抗(克隆145-2C11)由本實驗室通過真核表達系統(tǒng)重組表達制備。Traut’s試劑和Sulfo-SMCC(Sigma)。完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑(Sigma)。重組小鼠CD3-His蛋白(北京義翹神州)。辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記兔抗6×His標(biāo)簽抗體和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(Abcam)。

1. 3 抗CII/CD3雙抗制備[9-10]取20 mg抗小鼠CD3單抗與Traut’s試劑以摩爾比1∶10混合，然后在室溫條件下反應(yīng)1 h。另外取20 mg抗CII單抗與Sulfo-SMCC以摩爾比1∶10混合，然后同樣在室溫下反應(yīng)1 h。將反應(yīng)完后的抗小鼠CD3單抗和抗CII單抗分別濃縮換液后1∶1混合，在4 ℃條件下緩慢混合過夜反應(yīng)。然后通過分子篩柱Sephadex 200純化反應(yīng)產(chǎn)物得到抗CII/CD3雙抗。純化得到的抗CII/CD3雙抗經(jīng)非還原NuPAGE 4-12% Bis-Tris膠進行鑒定和純度分析。

1. 4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測抗CII/CD3雙抗與靶分子的結(jié)合活性 分別包被小鼠CD3和小鼠CII于ELISA板上，4 ℃孵育過夜。然后用含1%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)的含0.05%吐溫的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline with 0.05% TWEEN 20, PBST)封閉，25 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次后加入系列稀釋在含1% BSA的PBST溶液里的雙抗樣品以及對照單抗樣品，25 ℃孵育1 h。洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，25 ℃孵育1 h。然后加入底物四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine, TMB)溶液，室溫顯色10 min。最后加入1 mol/L H2SO4終止顯色，并在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光度。另外，包被小鼠CII于ELISA板上，封閉后加入雙抗樣品以及對照單抗樣品，然后再加入小鼠CD3-His, 最后加入HRP標(biāo)記兔抗6×His標(biāo)簽抗體，并加入底物TMB溶液顯色和讀取OD450值。

1. 5 改進型CIA模型制備及臨床觀察 將等體積牛CII溶液和完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑充分乳化后獲得膠原乳劑，然后于第0天注射0.01 mL包含70 μg牛CII和完全弗氏佐劑的乳劑到小鼠尾根部皮內(nèi)，3周以后注射包含70 μg牛CII和不完全弗氏佐劑的乳劑到小鼠尾部皮內(nèi)，錯開第1次注射位置，從而制備常規(guī)CIA模型。在改進型模型制備中，首先在第0天注射包含牛CII和完全弗氏佐劑的乳劑，然后于第21天分別腹腔注射抗CII單抗，抗小鼠CD3單抗，抗CII單抗+抗小鼠CD3單抗，或抗CII/CD3雙抗。單抗劑量為30 μg/只，雙抗為60 μg/只。每組10只小鼠。每隔2天檢查小鼠發(fā)病情況、進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，并且每4天稱重并記錄小鼠體重。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：正常，無皮膚發(fā)紅和腫脹；1分：輕度踝關(guān)節(jié)或部分腳趾紅腫；2分：踝關(guān)節(jié)到跗骨輕度紅腫；3分：踝關(guān)節(jié)到跖骨中度紅腫；4分：整個踝關(guān)節(jié)、足部和全部腳趾嚴重紅腫或關(guān)節(jié)強直、畸形。小鼠四肢分別觀察評分，然后將各肢體得分相加即為該小鼠關(guān)節(jié)炎總評分。

1. 6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Graphpad Prism軟件進行單因素方差分析(One way ANOVA)，比較各組間差異，當(dāng)P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 抗CII/CD3雙抗制備 先分別將抗小鼠CD3單抗與Traut’s試劑、抗CII單抗與Sulfo-SMCC反應(yīng)，然后將這2個反應(yīng)產(chǎn)物混合一起進行反應(yīng)，最后用分子篩凝膠色譜柱純化得到抗CII/CD3雙抗。通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，最終反應(yīng)產(chǎn)物在分子量約300 kDa處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期二聚體形式雙抗分子相符。通過分子篩柱純化去除未反應(yīng)的修飾抗體和多聚體后，可獲得純度較高的抗CII/CD3雙抗(圖1)。

2. 2 抗CII/CD3雙抗分別與CII和CD3的結(jié)合 ELISA試驗結(jié)果表明，抗CII/CD3雙抗能夠有效地與CII結(jié)合，結(jié)合能力與抗CII單抗相比稍有降低(圖2A)。同時，抗CII/CD3雙抗能夠有效地與小鼠CD3結(jié)合，結(jié)合能力與抗小鼠CD3單抗相當(dāng)(圖2B)。

圖1 抗CII/CD3雙抗的制備和鑒定
Fig.1 Preparation and identification of theanti-CII/CD3 bispecific antibodyM：分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1：抗CD3單抗； 2：抗CD3單抗-Traut’s； 3：抗CII單抗； 4：抗CII單抗-Sulfo-SMCC； 5：抗CII/CD3 雙抗-純化前； 6：抗CII/CD3雙抗-純化后
M: Molecular weight markers; 1: Anti-CD3 monoclonal antibody; 2: Anti-CD3 monoclonal antibody-Traut’s; 3: Anti-CII monoclonal antibody; 4: Anti-CII monoclonal antibody-Sulfo-SMCC; 5: Anti-CII/CD3 bispecific antibody-before purification; 6: Anti-CII/CD3 bispecific antibody-after purification

由于一分子抗CII/CD3雙抗含兩分子單克隆抗體，所以在用羊抗小鼠IgG二抗檢測時其信號較抗CII單抗和抗CD3單抗高。

2. 3 抗CII/CD3雙抗同時與CII和CD3的結(jié)合 先用小鼠CII包被ELISA板，孵育后加入抗CII/CD3雙抗樣品，然后再加入小鼠CD3-His, 最后加入兔抗6×His標(biāo)簽抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有抗CII/CD3雙抗能同時與CII和CD3結(jié)合，而抗CII單抗、抗CD3單抗和抗CII單抗+抗CD3單抗均不能同時結(jié)合2個靶分子(見圖3)。

2. 4 抗CII/CD3雙抗處理后小鼠體重變化 用常規(guī)方法進行CIA造模后，小鼠體重從初次膠原免疫后33 d左右開始下降，45 d左右下降到最低，此時與正常小鼠相比體重明顯降低，然后體重逐漸略有恢復(fù)。而在抗CD3單抗，抗CII單抗+抗CD3單抗和抗CII/CD3雙抗處理后小鼠體重即迅速下降，29 d 左右下降到最低程度，此時體重與正常小鼠和常規(guī)CIA小鼠相比均顯著降低(P<0.001)，然后體重稍有恢復(fù)。在61 d時抗CII/CD3雙抗處理組小鼠體重與常規(guī)CIA對照組小鼠相比無顯著性差異(P>0.05)(見圖4)。

圖2 抗CII/CD3雙抗與CII和CD3的結(jié)合
Fig.2 Binding of anti-CII/CD3 bispecific antibody to CII and CD3A:抗CII/CD3雙抗與CII的結(jié)合；B:抗CII/CD3雙抗與CD3的結(jié)合 A:Binding of anti-CII/CD3 bispecific antibody to CII; B:Binding of anti-CII/CD3 bispecific antibody to CD3

2. 5 抗CII/CD3雙抗處理后小鼠發(fā)病情況及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分 本試驗發(fā)現(xiàn)常規(guī)方法CIA造模小鼠平均發(fā)病時間為(33.3±2.4) d，而經(jīng)抗CII單抗、抗CD3單抗、抗CII單抗+抗CD3單抗和抗CII/CD3雙抗處理后小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病時間分別為(33.3±2.0) d、(29.8±1.0) d、(29.4±0.8) d和(25.4±0.8) d。因此相比常規(guī)CIA，抗CII/CD3雙抗能導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎發(fā)病時間明顯提前。本試驗還發(fā)現(xiàn)常規(guī)方法CIA造模小鼠發(fā)病率為70%，抗CII單抗處理組發(fā)病率為80%，而經(jīng)抗CD3單抗、抗CII單抗+抗CD3單抗和抗CII/CD3雙抗處理后小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率均為100%。另外，抗CII/CD3雙抗處理后關(guān)節(jié)炎發(fā)病程度較重(見中插彩版圖5)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分可以達到并穩(wěn)定在10分左右的水平，不僅明顯高于常規(guī)CIA小鼠和抗CII單抗處理組小鼠，也高于抗CD3單抗以及抗CII單抗+抗CD3單抗處理組的小鼠。并且，抗CII/CD3雙抗處理組小鼠個體間評分差異較小(見圖6)。

圖3 抗CII/CD3雙抗與CII和CD3的同時結(jié)合
Fig.3 Simultaneous binding of anti-CII/CD3bispecific antibody to both CII and CD3

圖4 抗CII/CD3雙抗處理后小鼠體重變化
Fig.4 Body weight change of the mice afteranti-CII/CD3 bispecific antibody treatment與CIA模型組比較，*：P<0.05，***：P<0.001； 與正常小鼠比較，###：P<0.001，####：P<0.000 1 Compared to CIA control mice, *：P<0.05, ***：P<0.001; Compared to normal mice,###：P<0.001,####：P<0.000 1

3 討論

動物疾病模型是研究人類疾病的一種十分重要的手段。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型對于研究該病的病因、發(fā)病機制、疾病發(fā)生和發(fā)展規(guī)律、開發(fā)新的診斷和治療方法以及新藥研發(fā)均具有十分重要的意義。

CIA模型是研究RA的較理想模型，但是該模型也有一些缺點。其主要缺點:一是造模時間長，膠原免疫后約需要1個月才開始發(fā)病，這就導(dǎo)致整個實驗周期較長、新藥研發(fā)效率較低；二是發(fā)病率偏低，在本實驗室SPF設(shè)施中飼養(yǎng)的小鼠經(jīng)誘導(dǎo)后發(fā)病率經(jīng)常只有70%左右；三是發(fā)病嚴重程度較低，有時候會導(dǎo)致治療組與模型對照組病變程度差距過小，難以判斷藥物的療效；四是動物個體間發(fā)病時間不一致，個體間疾病嚴重程度差異大，不同試驗間數(shù)據(jù)差異大等，這也為準(zhǔn)確評價和判定抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的療效帶來了較大的困難。因此，這些缺點大大限制了CIA模型的更廣泛應(yīng)用。

圖6 抗CII/CD3雙抗處理后小鼠關(guān)節(jié)炎評分變化
Fig.6 Change of arthritis score of the mice afteranti-CII/CD3 bispecific antibody treatment與抗CD3單抗組和抗CII單抗+抗CD3單抗組比較， *:P<0.05；與CIA模型組比較，***:P<0.001 Compared to the mice treated by anti-CD3 monoclonal antibody and by anti-CII monoclonal antibody + anti-CD3 monoclonal antibody, *:P<0.05; Compared to CIA control mice, ***:P<0.001

目前，抗腫瘤抗原/CD3雙抗在腫瘤治療領(lǐng)域已經(jīng)得到了較廣泛的應(yīng)用，并顯示出了優(yōu)異的抗腫瘤治療效果和良好的應(yīng)用前景[11-12]。但將基于抗CD3的雙抗用于關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)研究國內(nèi)外還未見報道。

本試驗中我們采用化學(xué)連接方法將抗 CII單抗和抗小鼠CD3單抗交聯(lián)而成功制備了抗CII/CD3雙抗。該雙抗較好地保持了和CII以及小鼠CD3靶分子的結(jié)合能力，更重要的是該雙抗能同時有效地結(jié)合CII和CD3分子，從而可能將表達CD3分子的T淋巴細胞聚集到表達CII的小鼠關(guān)節(jié)部位，并通過CII結(jié)合依賴的方式導(dǎo)致靜息T淋巴細胞活化、增殖，并且在關(guān)節(jié)局部釋放大量促炎性細胞因子如IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-6等[6,13]，從而可能能迅速啟動并增強小鼠CIA的發(fā)生和發(fā)展。

常規(guī)CIA模型制備一般采用2次CII免疫，但也有文獻報道加強免疫不是必需的，CII免疫1次即可成功制備CIA[3]。本實驗室前期試驗也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)單次CII免疫后給予PBS溶媒的小鼠其關(guān)節(jié)炎發(fā)病時間、發(fā)病率和關(guān)節(jié)炎評分變化趨勢等與常規(guī)CIA小鼠沒有明顯區(qū)別。而本試驗發(fā)現(xiàn)，在單次CII免疫

的基礎(chǔ)上，給予抗CII/CD3雙抗后4 d(即CII免疫后25 d)左右小鼠即開始發(fā)病，發(fā)病率達到100%，然后隨時間延長疾病嚴重程度迅速增加，并在5周左右疾病評分達到最大值，而且該關(guān)節(jié)炎癥狀能持續(xù)維持3周以上，并且小鼠個體間疾病嚴重程度差異較小。因此，通過這種方法建立的改進型關(guān)節(jié)炎模型相對于常規(guī)CIA模型具有明顯優(yōu)勢。但本試驗也發(fā)現(xiàn)，如果不經(jīng)過膠原誘導(dǎo)，單純給予抗CII/CD3雙抗并不能在DBA/1小鼠中誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎。這說明抗CII/CD3雙抗只能在小鼠體內(nèi)存在一定程度的抗CII免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上才能迅速啟動和增強關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

綜上所述，本試驗發(fā)現(xiàn)通過抗CII/CD3雙抗聯(lián)合膠原免疫可以成功建立一個發(fā)病時間短、發(fā)病率高、疾病嚴重程度高、動物個體間疾病嚴重程度較均一的改進型小鼠關(guān)節(jié)炎實驗動物模型，該模型的成功建立可以更好地為RA的發(fā)病機制研究、新的診斷和治療方法的開發(fā)，特別是抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的篩選和評價服務(wù)。