骨橋蛋白在尿結石綿羊泌尿系統(tǒng)的表達和定位

任 杰,武果桃,衛(wèi)順生,孟冬霞,閆益波,趙 娟

(山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,山西太原030032)

骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種帶負電荷的多功能非膠原性磷酸化糖蛋白,作為一種可溶性蛋白質存在于大多數(shù)體液和組織中，其相對分子質量約為44 kDa[1]。近年來關于OPN的已知功能研究結果如下：(1)通過精氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸組成的序列(RGD)結合于細胞表面,介導細胞、基質之間的相互作用；(2)刺激β細胞產生免疫球蛋白[2]；(3)促進免疫細胞、骨細胞和瘤細胞遷移[3-5]；(4)刺激骨的鈣化,改變細胞內鈣水平[4]；(5)促進骨組織內磷酸鈣的吸收。其中OPN 在骨組織中主要是成骨細胞分泌, 在骨礦化中發(fā)揮重要作用,能增強細胞粘附的蛋白質對羥基磷灰石結合能力。而尿結石的形成與骨礦化有許多相似之處，OPN含有與細胞外基質的礦物質表面相互作用的酸性結構域，能抑制培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的鈣化作用，在體外可抑制草酸鈣晶體的成核、生長和聚集[6-7], 但在體內能促進草酸鈣結石形成。而舍飼綿羊在育肥中后期大量高蛋白飼料的代謝產物極易蓄積。最終造成尿液離子過飽和與pH值升高，形成磷酸鹽結石[8]。本試驗觀察骨橋蛋白在綿羊磷酸鹽尿結石發(fā)病情況下在泌尿系統(tǒng)表達量的變化，以及在腎臟和膀胱的定位。從蛋白水平驗證骨橋蛋白與綿羊磷酸鹽尿結石發(fā)生的關系。

圖1 腎臟免疫組化(40×)
Fig.1 Immunohistochemistry of kidney(40×)
A:患病綿羊； B:健康綿羊 A: Sicken sheep; B: Healthy sheep

圖2 膀胱免疫組化(40×)
Fig.2 Immunohistochemistry of bladder(40×)
A:患病綿羊； B:健康綿羊 A: Sicken sheep; B:Healthy sheep

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蛋白提取試劑盒(C510003-0050)；蛋白濃度測定BCA試劑盒(SK3021)；β-acin抗體 (AB10001)； 兔抗OPN多克隆抗體(bs-0019R)；HRP conjugated Goat-anti-Rabbit IgG(AB10058)；發(fā)光試劑盒(SK6668)；免疫染色封閉液/一抗稀釋液(E674004-0100)；DAB免疫組織化學顯色試劑盒(E670033-1000)；檸檬酸鈉抗原修復液(E673001-0250)；免疫染色洗滌液(20×，E674003-0500)；蘇木素染色液(E607317-0100)；中性樹膠封片劑(E675007-0100)。以上試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 組織材料 山西晉中健源養(yǎng)殖場患病綿羊和健康綿羊各4只,取腎臟、膀胱組織快速置于液氮冷凍保存,用于總蛋白的提取,1塊置于Bouin′s固定液中固定,用于免疫組織化學分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白提取 按試劑盒說明書步驟提取蛋白。

1.3.2 蛋白濃度測定 按照每個樣本200 μL BCA工作液配制。標準濃度梯度為：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 μg/μL和0.5 μg/μL。酶標儀中震動5 s。60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30 min。冷卻至室溫后，測定各孔A492值,制作標準曲線,根據(jù)標準曲線計算出樣本的蛋白濃度。

1.3.3 Western Blot 取液氮冷凍的腎臟和膀胱組織,用總蛋白提取試劑盒提取腎臟組織總蛋白。上樣量20 μg。電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉。加入兔抗OPN多克隆抗體(TBST 1∶500稀釋),37 ℃ 1 h,4 ℃過夜。次日洗膜加入HRP conjugated Goat-anti-Rabbit IgG，1∶8 000稀釋，37 ℃孵育1 h。ECL曝光。DAB室溫顯色2～3 min,待出現(xiàn)棕黃色條帶時,終止顯色。

1.3.4 免疫組織化學 Bouin′s固定液固定的腎、膀胱組織通過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片,做成5 μm厚的組織切片。將切片置于60 ℃恒溫箱中烘烤60 min，清洗，封閉液室溫封閉45 min。一抗(Anti-OPN antibody, Bioss, bs-0019R)4 ℃冰箱孵育過夜。次日室溫放置60 min，洗滌。滴加二抗(HRP conjugated Goat-anti-Rabbit IgG)，室溫孵育60 min，洗滌、顯色。洗滌加蓋玻片中性樹膠封片。顯微鏡拍片。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 應用Image-pro plus 6.0軟件對OPN蛋白在腎、膀胱組織中的免疫組織化學染色結果進行光密度測定,每個組織取4張切片,每張切片取5個視野,得到陽性細胞的光密度值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 forwindows軟件,應用方差分析進行統(tǒng)計學分析。所測數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。不同樣本細胞中光密度(Optical density, OD)用單因子方差分析。應用Image-pro plus 6.0軟件對綿羊OPN免疫印跡結果進行分析,測定目的條帶面積和灰度值。分析結果用平均值±標準誤(Means±SE)表示。

2 結果

2.1 蛋白濃度測定 在綿羊腎臟蛋白濃度，患病綿羊為(11.82±0.44) μg/μL，健康綿羊為(8.68±0.56) μg/μL，差異極顯著(P<0.01)。膀胱蛋白濃度，患病綿羊為(14.32±0.82) μg/μL，健康綿羊為(12.43±0.75) μg/μL，差異顯著(P<0.05),見表1。

表1 不同部位蛋白濃度測定結果Table 1 Results of different parts protein concentration determination (μg/μL)

2.2 Western Blot結果 綿羊腎臟總蛋白中存在能與兔抗OPN多克隆抗體發(fā)生免疫陽性反應的蛋白條帶。OPN蛋白在患病與健康綿羊腎臟組織中的平均蛋白濃度為(2.873 2±0.035 6) μg/μL和(2.358 9±0.047 1) μg/μL，差異極顯著(P<0.01)。綿羊膀胱總蛋白中同樣存在能與兔抗OPN多克隆抗體發(fā)生免疫陽性反應的蛋白條帶。OPN蛋白在患病與健康綿羊膀胱組織中的平均蛋白濃度為(3.493 2±0.053 7) μg/μL和(3.055 9±0.067 4) μg/μL，差異顯著(P<0.05)。

2.3 免疫組化 腎臟OPN免疫組織化學染色結果顯示, 光鏡下可見腎小管上皮細胞表達OPN，主要定位于胞質，呈棕褐色。患病綿羊表達明顯增多，色較深，平均吸光度為0.028 51±0.008 0；健康綿羊腎小管上皮細胞表達較少，色較淺，平均吸光度為0.013 89±0.004 5。患病綿羊與健康綿羊差異極顯著(P<0.01)。見中插彩版圖1。膀胱OPN免疫組織化學染色結果顯示, 光鏡下可見膀胱移行上皮細胞表達OPN，以及平滑肌少量表達，主要定位于細胞胞質，呈棕褐色。患病綿羊表達明顯增多，色較深，平均吸光度為0.038 4±0.023 0；健康綿羊表達較少，色較淺，平均吸光度為0.029 76±0.012 9。患病綿羊與健康綿羊差異顯著(P<0.05)。見中插彩版圖2。

3 討論

作為一種多功能蛋白，OPN在許多系統(tǒng)功能中發(fā)揮作用[9]，其中在骨形成的研究較多，在骨基質的礦化和吸收過程中對鈣介導和鈣依賴的某些過程有參與細胞遷移，是一個主動的調控過程[10]。而尿結石的形成也存在類似鈣化的過程，許多研究表明，骨橋蛋白在草酸鈣晶體的形成過程中存在相關性。Wesson等[11]用乙二醇分別誘導OPN基因敲除的成年小鼠和正常小鼠，形成高草酸尿模型，到第4周后，OPN基因敲除小鼠的腎小管內形成大量草酸鈣晶體，而正常小鼠則無晶體形成。吳敬彰等[12]研究OPN在結石患者腎組織中的表達時發(fā)現(xiàn)，結石組患者腎組織中的OPN表達量顯著高于對照組。趙明等[13]在研究骨橋蛋白對大鼠發(fā)生草酸鈣腎臟結石的影響時發(fā)現(xiàn)， OPN siRNA組OPN蛋白表達水平和草酸鈣結石顯著低于空載組，顯著高于對照組。鄧茂放等[14]在研究烏梅提取物對腎結石模型大鼠腎功能的保護作用及機制時發(fā)現(xiàn)，模型組和試驗組腎組織中OPN蛋白免疫組化評分和OPN蛋白表達量明顯高于正常組。以上研究都表明，OPN在草酸鈣晶體轉化為腎結石過程中起關鍵作用。另外，膀胱和尿液中OPN通過影響晶體結晶而影響草酸鈣結石形成。Thurgood等[15]研究表明，OPN抑制草酸鈣晶體生長，并且抑制作用呈劑量依賴性。王炎等[16]在研究加味健脾益腎方對腎結石術后尿骨橋蛋白的影響時發(fā)現(xiàn)，治療組尿OPN含量比治療前明顯升高。而Konya等[17]研究草酸鈣晶體聚集和生長的抑制活性過程中發(fā)現(xiàn)，尿液中OPN能增加草酸鈣晶體的粘附和聚集，并且可以増加新形成的晶體的粘附力，OPN被草酸鈣包裹成為結晶形成的始發(fā)部位，從而促進草酸鈣結石的形成。

本試驗對4只發(fā)生尿結石綿羊剖檢確定都為磷酸鹽結石，并隨機抽取4只健康綿羊進行取樣。在腎臟OPN蛋白表達，發(fā)病組極顯著高于健康組，而膀胱上OPN的表達，發(fā)病組顯著高于健康組，與吳敬彰等[12]的研究結果相同。但膀胱上OPN的表達量均高于腎臟，說明OPN在膀胱上表達高于腎臟。另外，免疫組化試驗結果也驗證了這一觀點。

4 小結

尿結石是一種由多因素影響、形成過程非常復雜的疾病，目前其發(fā)病機制還有待研究。OPN在尿結石結晶形成中扮演著重要的角色。雖然已經對OPN與尿結石的關系做了許多研究，但目前仍不能明確其在尿結石形成過程中的具體作用。本試驗在確定綿羊磷酸鹽結石情況下，對患有尿結石綿羊和健康綿羊進行腎臟與膀胱OPN蛋白的表達和定位，結果顯示，骨橋蛋白在尿結石綿羊和健康綿羊腎、膀胱組織中定位以及表達存在一定差異，表明骨橋蛋白與綿羊磷酸鹽尿結石形成有關。