鵝源鼠傷寒沙門菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

孔 銘,高 尚,徐 磊,王彥紅,王曉泉

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225009 ； 2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州225009)

沙門菌是腸桿菌科的重要成員，革蘭陰性桿菌，是重要的人獸共患病原體，在獸醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)上都具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。其血清型多達(dá)2 600種以上[1]，其中鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium)隸屬于沙門菌B群，是目前世界上分離率最高的菌型之一[2]，也是導(dǎo)致家禽傳染病的常見(jiàn)菌之一。鼠傷寒沙門菌嚴(yán)重影響畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育，降低其商品價(jià)值，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其臨床癥狀常表現(xiàn)為胃腸炎或敗血癥兩類。目前臨床上常選擇抗生素治療細(xì)菌性疾病的同時(shí)，也導(dǎo)致了抗生素耐藥菌株數(shù)量逐年增加。本試驗(yàn)對(duì)臨床分離的鼠傷寒沙門菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其耐藥性進(jìn)行了初步分析，為科學(xué)防治沙門菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 用市售的綿羊血和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉按標(biāo)準(zhǔn)配方自行配置血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基；沙門菌屬診斷血清，購(gòu)自中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán)公司蘭州生物制品研究所。

1.2 病料來(lái)源 2017年在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院畜禽門診部收到4例送檢的病死鵝，具體如下。

E1：2017年3月江蘇揚(yáng)州某養(yǎng)殖者共飼養(yǎng)1 000只鵝，7日齡開(kāi)始發(fā)病，用氟苯尼考飲水1 d，曾2次注射小鵝瘟疫苗，送檢5只，剖檢發(fā)現(xiàn)肝土黃色，脾腫脹，糞便紅色，肺部有霉菌結(jié)節(jié)。采取肝組織以備用。

E2：2017年4月江蘇揚(yáng)州某養(yǎng)殖者共飼養(yǎng)1 000只鵝，10日齡出現(xiàn)死亡，15日齡送檢5只，剖檢發(fā)現(xiàn)小腸黏膜水腫、充血，伴有痛風(fēng)癥狀。采取肝組織以備用。

E3：2017年5月江蘇揚(yáng)州某養(yǎng)殖者共飼養(yǎng)1 000只鵝，10日齡出現(xiàn)死亡，死亡200只，15日齡送檢6只，剖檢發(fā)現(xiàn)胃腸黏膜腫脹，呈彌漫性紫紅色，伴有痛風(fēng)癥狀。采取肝組織以備用。

E4：2017年12月淮安漣水縣某養(yǎng)殖者共飼養(yǎng)4 000只，9日齡出現(xiàn)死亡，每天死亡20～30只，并開(kāi)始用藥，但用藥不祥。14日齡送檢病死鵝6只，剖檢主要癥狀為心包炎、肝周炎、氣囊炎。采取肝組織以備用。

1.3 細(xì)菌分離 采集病死鵝的肝臟和脾臟，無(wú)菌接種于血平板上，倒置放于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。無(wú)菌挑取單個(gè)菌落分別接種于血平板和麥康凱平板上進(jìn)行純化傳代。

1.4invA基因鑒定 本試驗(yàn)利用PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行沙門菌的鑒定。將分離株采用煮沸裂解法制備細(xì)菌基因組DNA模板，參考文獻(xiàn)[4-5]合成具有種屬特異性的沙門菌特異性蛋白invA基因引物。PCR反應(yīng)體系為 25 μL：10×LA PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture 0.5 μL、Taq聚合酶 0.25 μL、DNA 模板 2 μL、上下游引物各 0.25 μL，加入滅菌雙蒸水至 25 μL。PCR 程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30s，52 ℃退火45s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃ 5 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 生化試驗(yàn) 用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、硫化氫、靛基質(zhì)、M.R.、V-P、硝酸鹽還原對(duì)照生化管中，于 37 ℃溫箱中培養(yǎng) 24 h。根據(jù)生化反應(yīng)對(duì)照管進(jìn)行判定。

1.6 血清型試驗(yàn) 采用玻板凝集試驗(yàn)，挑取血平板上的單個(gè)待檢菌落使用沙門菌O抗原多價(jià)A-F群血清進(jìn)行鑒定，設(shè)立生理鹽水為對(duì)照組。若出現(xiàn)凝集，則待檢菌屬于O抗原A-F群，依次用A-I群O抗原單價(jià)診斷血清判斷待檢菌O群，依據(jù)各O群所具有的單價(jià)因子依次對(duì)待檢菌進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)確定其O抗原血清型，并結(jié)合待檢菌與H抗原診斷血清的玻板凝集試驗(yàn)結(jié)果最終判斷其血清型。

1.7 藥敏試驗(yàn) 采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。選用15種藥敏紙片，包括多黏菌素B、慶大霉素、頭孢曲松、多西環(huán)素、丁胺卡那霉素、諾氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、卡那霉素、鏈霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉素、美洛西林、新霉素。挑取純培養(yǎng)菌株均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，無(wú)菌取藥敏紙片均勻貼于平板瓊脂面上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后，用測(cè)量尺測(cè)量抑菌圈的直徑。15種藥物判斷標(biāo)準(zhǔn)參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS,2005年)藥敏紙片擴(kuò)散法。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 4份病料在血瓊脂平板上形成透明的菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成無(wú)色、光滑、圓形的菌落。挑取單個(gè)純培養(yǎng)后的菌落于載玻片上進(jìn)行革蘭染色，鏡檢分離菌為紅色直桿狀，大多散在或成對(duì)存在。分離菌株分別為E1、E2、E3和E4。

2.2invA基因鑒定 根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，4株分離菌均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的330 bp的目的條帶(見(jiàn)圖1)，分離株均為沙門菌。

圖1 鼠傷寒沙門菌invA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
Fig.1 Amplification products of theS. typhimuriuminvAgene PCRM:100 bp DNA Marker; 1～4: 樣品; 5: 陽(yáng)性對(duì)照 M:100 bp DNA Marker; 1～4: Sample; 5: Positive control

2.3 生化試驗(yàn) 結(jié)果顯示，4株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和甘露醇，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，能還原硝酸鹽，吲哚試驗(yàn)陰性，M.R.試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，不分解尿素，均能產(chǎn)生H2S，生化試驗(yàn)均符合沙門菌特點(diǎn)。

2.4 血清型分型 4株分離菌均能與O4、O5、O12因子、H1、H2抗原血清發(fā)生凝集。因此，4個(gè)分離株的血清型均為[4,5,12∶i∶1,2]，與鼠傷寒沙門菌的抗原模式一致，因此4株分離菌均為鼠傷寒沙門菌。

2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示：4株分離菌均對(duì)諾氟沙星、頭孢曲松、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉素等敏感，均對(duì)多西環(huán)素和多黏菌素B耐藥。除此之外，E2分離菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥；E4分離菌對(duì)鏈霉素耐藥，因此，這2株細(xì)菌表現(xiàn)出多重耐藥性。

表2 4株分離菌對(duì)不同藥物的耐藥情況Table 2 Resistance of 4 isolates to different drugs

3 討論

本試驗(yàn)所分離到的4株細(xì)菌，均來(lái)自2017年4個(gè) 養(yǎng)殖場(chǎng)所送檢至揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院畜禽門診部的病料。這些細(xì)菌經(jīng)過(guò)PCR試驗(yàn)和生化試驗(yàn)鑒定，均為沙門菌，通過(guò)血清型鑒定后，4株分離菌均為鼠傷寒沙門菌。鼠傷寒沙門菌是引起禽副傷寒疾病的主要病原體，且能感染各種動(dòng)物和人類，其感染率和發(fā)病率均較高，可導(dǎo)致暴發(fā)性食物中毒[6]，具有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義。禽沙門菌病可以垂直傳播。此外，污穢潮濕的環(huán)境、畜舍堆積糞便不及時(shí)清理、擁擠、通風(fēng)不良、溫度濕度相差過(guò)大等均能加快鼠傷寒沙門菌的傳播。因此，加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理，消除發(fā)病誘因，對(duì)種蛋進(jìn)行嚴(yán)格消毒，加強(qiáng)育雛間的保暖等，可以在一定程度上預(yù)防本病的發(fā)生。

目前，臨床上大多采用抗生素治療細(xì)菌性疾病，感染鼠傷寒沙門菌也不例外。也正是因?yàn)榈貐^(qū)生態(tài)環(huán)境以及養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理的差異，盲目使用不同種類的抗生素，導(dǎo)致沙門菌耐藥性不斷上升，耐藥譜不斷的擴(kuò)大，多重耐藥菌株的數(shù)量不斷增加。沈?qū)W懷等[7]報(bào)道中所分離到的2株禽源鼠傷寒沙門菌表現(xiàn)出7重，甚至10重的嚴(yán)重耐藥性。本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，此次分離的鵝源鼠傷寒沙門菌對(duì)氟喹諾酮類藥物諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星，β內(nèi)酰胺類藥物頭孢曲松，氨基糖苷類藥物慶大霉素、妥布霉素敏感。因此，這些藥物可以作為送檢養(yǎng)殖場(chǎng)防治鵝源鼠傷寒沙門菌的首選藥物，減少其他抗生素藥物的使用，同時(shí)給予維生素，提高畜禽免疫力，降低畜禽鼠傷寒沙門菌病的發(fā)病率，從而降低死亡率。此外，具有多重耐藥性的E2、E4菌株所在的養(yǎng)殖場(chǎng)，普遍存在因長(zhǎng)期、大量使用抗生素的現(xiàn)象。綜上，鼠傷寒沙門菌的治療要建立在嚴(yán)格的藥敏試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇抗生素要從其種類、質(zhì)量、劑量、療程和藥效等方面考慮，切勿憑借以往的治療經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行給藥治療。同時(shí)，一旦發(fā)現(xiàn)類似鼠傷寒沙門菌的癥狀時(shí)，應(yīng)當(dāng)及時(shí)就診。