犬冠狀病毒的進(jìn)化和致病性研究進(jìn)展

劉玉秀,黃柏成,習(xí)向鋒,田克恭

(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心,河南洛陽(yáng)471000)

長(zhǎng)期以來(lái)，人冠狀病毒(Human Coronavirus，HCoV)因僅在健康人群中引起輕度癥狀而一直未被重視。直到2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)疫情的暴發(fā)[1]，其病原SARS冠狀病毒(SARS-CoV)高傳播力和高致死率，才引起人類對(duì)動(dòng)物冠狀病毒作為直接和間接人獸共患病潛在病原的興趣。2019年底，由SARS-CoV-2感染暴發(fā)的新冠肺炎(COVID-19)[2]在全球廣泛流行并造成巨大損失。由于冠狀病毒基因組的易突變性，所形成的新型病毒可能在增強(qiáng)病毒致病力和強(qiáng)流行性中起到重要作用。冠狀病毒基因組的易突變性也造成犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCoV)新毒株的出現(xiàn)。近年來(lái)，犬群中出現(xiàn)與經(jīng)典犬冠狀病毒(CCoV)具有不同生物學(xué)和遺傳學(xué)特性的毒株，對(duì)犬類疾病鑒別診斷及防控造成了極大挑戰(zhàn)。本文對(duì)近年來(lái)CCoV在基因演變、組織嗜性變化上的發(fā)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)CCoV疫苗保護(hù)效果不足的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了討論，以期為新型冠狀病毒防控及疫苗開發(fā)提供一些借鑒。

1 冠狀病毒分類與基因組組成

冠狀病毒(Coronaviruses，CoV)屬于單股正鏈RNA病毒，可在哺乳動(dòng)物和鳥類中引起支氣管炎、胃腸炎、肝炎、傳染性腹膜炎和腦炎等多種疾病。冠狀病毒科(Coronaviridae)分為α、β、γ和δ四個(gè)屬[3]。α屬包括8個(gè)種，即α冠狀病毒1、人冠狀病毒229E、人冠狀病毒NL63、長(zhǎng)翼蝠冠狀病毒HKU1、菊頭蝠冠狀病毒HKU2和豬流行性腹瀉病毒等。其中犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCoV)、貓冠狀病毒(Feline coronavirus，F(xiàn)CoV)和豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是α冠狀病毒1的成員；β屬包括7個(gè)種，即β冠狀病毒1、人冠狀病毒HKU1、小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)、家蝠冠狀病毒HKU5、果蝠冠狀病毒HKU9、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2等。其中犬呼吸道冠狀病毒(Canine respiratory coronavirus，CRCoV)和牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)、人冠狀病毒OC43、馬冠狀病毒(ECoV)和豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)同屬于β冠狀病毒1成員；δ屬包括7個(gè)種，多為鳥類和禽類冠狀病毒如赤頸鴨冠狀病毒HKU20，γ屬包括白鯨冠狀病毒和雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis virus，IBV)等[3]。2019年底，引起全球流行新冠肺炎(2019-nCoV)的SARS-CoV-2為β冠狀病毒屬，S基因同源性進(jìn)化結(jié)果顯示，其與α冠狀病毒屬的CCoV和FCoV的核苷酸和氨基酸同源性分別為44.2%～46.4%和22.5%～24%；與同是β冠狀病毒屬的犬呼吸道冠狀病毒CRCoV的核苷酸和氨基酸同源性為45.3%和28.8%。SARS-CoV-2與先前描述的任何動(dòng)物冠狀病毒都沒有密切關(guān)系，如圖1所示。

CoV的基因組約27～32 kb，含7～11個(gè)開放閱讀框(ORF)編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。基因1由2個(gè)部分重疊的ORF1a和ORF1b組成，翻譯病毒復(fù)制酶(Rep)前體蛋白。復(fù)制酶基因下游的4～5種基因ORF(5’-Rep-S-E-M-N-3’)或(5’-Rep-HE-S-E-M-N-3’)編碼結(jié)構(gòu)蛋白[5]，分別是棘突蛋白S(Spike protein)、核衣殼蛋白N(Nucleocapsid protein)、膜蛋白M(Mermbrane protein)、小膜蛋白E(Small membrane protein)和血凝素酯酶HE(Hemagglutinin esterase)。

成熟的S蛋白具有多種生物學(xué)功能，包括與宿主受體結(jié)合、誘導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體、與病毒毒力強(qiáng)弱密切相關(guān)，其還影響某些冠狀病毒的血凝性，如PHEV和IBV等具有血凝特性[5]。M蛋白是橫跨于病毒囊膜上的糖蛋白，主要負(fù)責(zé)病毒顆粒的組裝[5]。M蛋白糖基化序列高度保守，其糖鏈主要由N-(主要是α-和γ-CoV)或O-(主要是β-CoV)方式連接到膜蛋白上[2，5]，M蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素[6]。E蛋白是一種在CoV中含量很少的小包膜蛋白，與M蛋白共表達(dá)形成E-M蛋白復(fù)合體，產(chǎn)生病毒樣粒子，E蛋白缺失可導(dǎo)致病毒粒子的復(fù)制量大大減少，病毒最終形態(tài)的形成與E蛋白密切相關(guān)[6]。HE蛋白主要存在于β冠狀病毒(如PHEV、CRCoV和MHV)，也見于γ冠狀病毒禽冠狀病毒中，而SARS-CoV是β冠狀病毒典型的非HE病毒[7]。HE蛋白介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜最初的吸附。HE蛋白具有乙肽脂酶活性，能在乙肽化的神經(jīng)氨酸上切割乙肽基團(tuán)，防止或逆轉(zhuǎn)S蛋白或HE引起的凝血或血細(xì)胞吸附效應(yīng)[8]。HE蛋白對(duì)于病毒復(fù)制非必需，在β冠狀病毒中高度變異，在連續(xù)病毒傳代過(guò)程中頻繁發(fā)生突變和缺失，它的存在與否可改變病毒在動(dòng)物體內(nèi)的致病性[8]。

圖1 SARS-CoV-2與犬貓不同基因型冠狀病毒遺傳進(jìn)化關(guān)系

2 犬腸道型冠狀病毒

1971年Binn等首次在急性腸炎犬中分離到CCoV[9]。CCoV感染常局限于消化道，引起輕度或重度胃腸炎，以高發(fā)病率和低死亡率為特征。CCoV有2種基因型：CCoV-I和CCoV-II，2種基因型S基因相似率54%[10]，通過(guò)擴(kuò)增基因組ORF2和ORF5片段即可鑒別[11]。此外，CCoV-I型基因組含有獨(dú)特的ORF3(624 nt)，該基因片段在CCoV-II和與其相關(guān)的FCoV-1和TGEV的基因組中僅有少量殘留[12]。CCoV-II存在2種亞型，CCoV IIa和CCoV IIb，前者為經(jīng)典的CCoVs毒株，后者是CCoV II和TGEV重組的TGEV樣毒株，在犬群中廣泛存在[13]。與其他CoV類似，CCoV基因很容易突變，過(guò)去十幾年出現(xiàn)多株具有潛在強(qiáng)毒力和基因差異的新CCoV毒株；澳大利亞流行的可導(dǎo)致急性致死性胃腸炎的CCoV II型毒株(UWSMN-1株)的ORF1b、S基因和5′端與經(jīng)典CCoV II毒株相似率分別為96.1%、86.1%和93.0%；系統(tǒng)進(jìn)化顯示，UWSMN-1株有別于經(jīng)典CCoV和FCoV，單獨(dú)形成一個(gè)分支，表明突變是在其整個(gè)病毒基因組中逐漸積累而成，不是CCoV和FCoV之間的重組產(chǎn)物[14]。2004年英國(guó)暴發(fā)了由CCoV II型高致病性毒株引起的疫情，流行株的基因組存在一個(gè)超長(zhǎng)的編碼非結(jié)構(gòu)蛋白基因3b(250aa)和高度分化M基因[15]；在意大利腹瀉犬中檢測(cè)到幾種CCoV在M基因出現(xiàn)點(diǎn)突變，有向FCoV I型的遺傳漂移的趨勢(shì)，其S蛋白序列與FCoV相似性達(dá)81%[16]。

3 泛嗜性犬冠狀病毒

2005年，意大利病死犬的腦組織中分離的CCoV II型變種(CB/05株)可引起感染犬嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病[17]，包括發(fā)熱(39.5～40.8 ℃)、嗜睡、消化道癥狀(嘔吐、腹瀉)、嚴(yán)重白細(xì)胞減少和神經(jīng)癥狀(共濟(jì)失調(diào)和驚厥)，發(fā)病后2 d內(nèi)死亡。肺、肝、腎和脾有嚴(yán)重病變，在肺、脾、肝、腎和腦組織中均檢測(cè)到CCoV II型RNA；此后2008-2009年在法國(guó)、比利時(shí)和希臘均有泛嗜性CCoV引起嚴(yán)重致死性疾病流行。研究顯示，CB/05株與腸道型CCoV-II在ORF2氨基酸序列高度相似，S蛋白與FCoV II毒株79-1683株相似性最高，但CB/05株在ORF3b有1個(gè)38 nt基因缺失標(biāo)記，是泛嗜性CCoV遺傳標(biāo)記[18]，目前該病毒泛嗜性相關(guān)遺傳變化尚待確定。腦組織中分離的CB/05株有力地表明，CCoV可改變?cè)械慕M織感染嗜性，獲得了從腸道傳播至其他內(nèi)臟的能力[19]。泛嗜性CCoV是否因基因的變化變成可識(shí)別其他受體還未知，期望可建立反向遺傳系統(tǒng)來(lái)研究病毒毒力和組織感染嗜性變化等相關(guān)研究。

4 犬呼吸道冠狀病毒

2003年出現(xiàn)人SARS-CoV后，加強(qiáng)了犬群中冠狀病毒流行病學(xué)調(diào)研。同年，英國(guó)從患地方性呼吸道疾病犬中分離1株CoV[18]，輕度上呼吸道癥狀犬中該毒株感染率較高，被稱為犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)。CRCoV的復(fù)制酶基因和S基因與BCoV遺傳關(guān)系密切。T101株CRCoV的S基因與BCoV和HCoV-OC43株S基因相似率分別為97.3%和96.9%，提示3種病毒有相近的共同祖先，并在不同宿主生物中重復(fù)轉(zhuǎn)移[20-21]。BCoV經(jīng)典毒株可感染幼犬，這為CRCoV來(lái)源于牛源病毒提供了佐證[22]。基因水平顯示CRCoV與CCoV無(wú)關(guān)，其S基因與腸道CCoV同源性僅21.2%[18]。

CRCoV在主要結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中與BCoV亞群遺傳關(guān)系密切。BCoV基因組S基因和E基因中間有3個(gè)不同的ORF，分別編碼4.9、4.8 kDa和12.7 kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白，而CRCoV基因組在該區(qū)域由于2 nt的缺失引起對(duì)應(yīng)BCoV基因組編碼4.9 kDa非結(jié)構(gòu)蛋白的終止密碼子缺失而導(dǎo)致形成8.8 kDa聯(lián)合蛋白的翻譯，導(dǎo)致只含有2個(gè)ORF分別編碼8.8 kDa和12.8 kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白[23]。與腸道CCoV I和CCoV II型不同，單純的CRCoV僅引起犬輕微呼吸道癥狀，但CRCoV在呼吸道上皮細(xì)胞中的復(fù)制可能損害黏液纖毛系統(tǒng)，導(dǎo)致由其他呼吸道病原體感染引起更嚴(yán)重的臨床過(guò)程。

5 犬冠狀病毒感染的防控

CCoV具有高傳染性，一旦暴發(fā)傳播就難以控制，感染犬可連續(xù)排毒6個(gè)月[17]。CCoV滅活疫苗(Duramune P C, Fort Dodge)是CoV中為數(shù)不多獲得生產(chǎn)許可的疫苗。該CCoV滅活疫苗皮下免疫后免疫保護(hù)欠佳，雖能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平抗體，攻毒后沒有明顯保護(hù)作用[24-25]，不能有效減少感染后排毒，不能有效阻斷病毒傳播。經(jīng)口鼻免疫減毒活疫苗也不能對(duì)疾病和感染產(chǎn)生完全保護(hù)[26]；在血清水平，CCoV I型和CCoV II型之間交叉反應(yīng)性較差[27]，即使是減毒活疫苗也不能預(yù)防CCoV I型攻毒后的感染。

此外，新型腸道CCoV基因型和泛嗜性CCoV病理類型的出現(xiàn)，對(duì)腸道CCoV疫苗的保護(hù)效力提出新的挑戰(zhàn)。泛嗜性CCoV的CB/05毒株具有明顯淋巴嗜性，犬感染1周后T淋巴細(xì)胞大量消耗，CD8+細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞在感染后第7天恢復(fù)至正常水平，外周血CD4+T淋巴細(xì)胞長(zhǎng)期消耗可能影響體液免疫和細(xì)胞免疫，從而損害有效免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和維持能力[28]，嚴(yán)重?fù)p害犬對(duì)并發(fā)病原或疫苗抗原的免疫反應(yīng)。犬舍和動(dòng)物收容所的幼犬暴露于多種病原中，同時(shí)感染泛嗜性CCoV可能會(huì)加劇其他病毒的臨床進(jìn)程，從而導(dǎo)致幼犬迅速死亡。其次，CCoV滅活疫苗推薦的首免時(shí)間是40～60日齡，也是CCoV感染幾率最高的時(shí)機(jī)。

目前，所有商品化腸道CCoV滅活疫苗不能保護(hù)幼犬來(lái)自泛嗜性CCoV的攻毒，免疫犬感染泛嗜性CCoV會(huì)出現(xiàn)亞臨床癥狀，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少，這可能是機(jī)會(huì)性病原體和由“真”病原體(CDV、CAV和CPV等)誘發(fā)更嚴(yán)重疾病的一個(gè)易感因素，且犬在康復(fù)后6個(gè)月還能檢測(cè)到排毒[18]。至于能否抵抗CRCoV感染尚不明確。CCoV滅活疫苗產(chǎn)生的免疫效力和持續(xù)時(shí)間尚未得到證實(shí)。減毒活疫苗接種后有較高頻率的副反應(yīng)，人們對(duì)CCoV疫苗在田間試驗(yàn)提供的免疫保護(hù)力存在較大爭(zhēng)議。

6 展望

基因組點(diǎn)突變積累及插入或缺失都是導(dǎo)致RNA病毒微進(jìn)化的主導(dǎo)力量，導(dǎo)致病毒株、血清型和基因亞型的增多[4]。幾十年來(lái)，CCoV通過(guò)某些區(qū)域基因的點(diǎn)突變和積累而不是基因重組經(jīng)歷了一次次遺傳進(jìn)化。ORFs2群體特異基因的變化被認(rèn)為是CCoV II型毒力增強(qiáng)的原因[16]。S基因點(diǎn)突變也被認(rèn)為與泛嗜性CCoV的發(fā)生有關(guān)[18]。CRCoV可能是1株BCoV的宿主從牛到犬的變種[18, 20]。因此，在HCoV(如SARS-CoV和SARS-CoV-2)的研究中，我們要研究CoV的非人類宿主來(lái)源，更需要關(guān)注是哪些基因的突變累積或插入或缺失使新型CoV的致病力和傳染性增強(qiáng)？

CCoV在長(zhǎng)期的毒株進(jìn)化演變過(guò)程中，突變出致病力更強(qiáng)，對(duì)宿主組織嗜性更廣泛的犬泛嗜性CCoV，引起感染犬短時(shí)間淋巴細(xì)胞大量消耗，增加了感染其他致死性病原的風(fēng)險(xiǎn)，造成不可逆轉(zhuǎn)全身性疾病；泛嗜性CCoV的出現(xiàn)，對(duì)CCoV感染的防控提出新的挑戰(zhàn)，也是對(duì)HCoV進(jìn)化的重要提示，HCoV由原來(lái)僅引起人普通感冒的毒株，進(jìn)化演變成嚴(yán)重下呼吸道、肺炎的嚴(yán)重疾病，是否也存在人冠狀病毒某些突變導(dǎo)致可識(shí)別新的受體引起？

犬冠狀病疫苗田間試驗(yàn)免疫接種的益處未達(dá)預(yù)期，CCoV I型和CCoV II型交叉保護(hù)性低。新基因型CCoV、泛嗜性CCoV及呼吸道CRCoV的出現(xiàn)，使腸道CCoV滅活疫苗接種后不能有效抵抗野毒感染。此外，CCoV疫苗不能有效降低感染后排毒和阻斷病毒傳播。期望人新型CoV疫苗的研發(fā)過(guò)程中，要規(guī)避犬冠狀疫苗的缺陷，真正起到預(yù)防控制疾病作用。

我們還需要進(jìn)一步研究來(lái)揭示導(dǎo)致CoV病理生物學(xué)改變的分子機(jī)制，為理解CoV致病性和免疫機(jī)理提供新的見解。同時(shí)，持續(xù)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)將有助于發(fā)現(xiàn)具有不同遺傳生物學(xué)特性的毒株，為深入了解動(dòng)物CoV的致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。