CRISPR/Cas9技術及其在胰腺癌研究中的應用進展

莊云英，張海燕 綜述 曾清芳 審校

胰腺癌是消化系統腫瘤中惡性程度較高的一種，具有較高的病死率。據統計，2019年美國有56 770例胰腺癌新病例和45 750例胰腺相關死亡病例，與其他常見的癌癥相比，胰腺癌的患者預后一直未得到明顯改善，5年相對生存率僅為9%[1]。盡管國內外各個科研團隊在探究胰腺癌更好的治療策略方面已經付出了相當大的努力，如靶向治療、免疫治療和潛在的規律成簇的間隔短回文重復序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) 相關蛋白9(RISPR/Cas9)定向基因治療等，但手術、放療和化療仍然是當前臨床上胰腺癌的主要治療方法。

目前，RISPR/Cas9已經成為一種強大的基因編輯工具，并在精準醫療領域具有潛力。CRISPR重復序列最早由Ishino等[2]在1987年發現，隨后在2012年，Jinek等[3]的研究證明了一個內切酶可以被一個雙RNA結構誘導直接切割目標DNA。從那時起，CRISPR/Cas9技術迅速發展，并促進基礎和臨床研究取得了驚人的進展。與其他基因編輯技術相比，如巨核酸酶 (meganucleases，MNs)、鋅指核酸酶 (zinc finger nucleases，ZFNs)、轉錄激活子樣效應核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，CRISPR/Cas9技術成本更低、效率更高、應用更簡單[4]。由于近年來CRISPR/Cas9技術在多個領域取得了突飛猛進的進展，筆者就CRISPR/Cas9及其在胰腺癌中的應用進行綜述。

1 CRISPR/Cas9技術

有規則間隔的短回文重復聚類 (CRISPR)是Ishino等[2]在大腸桿菌中發現了一段高度保守的核苷酸序列，它位于同工酶轉化堿性磷酸酶基因3’末端的側邊區域，表現為14 bp的二元對稱。然而，直到2007年Barrangou等[5]將嗜熱鏈球菌暴露于噬菌體中并對由此產生的抗噬菌體變體進行測序，人們才充分認識到CRISPR序列的功能和生物學重要性。對變異DNA的分析表明，這種細菌從噬菌體基因組中獲得了的新的CRISPR間隔。隨后，對細菌基因組中CRISPR序列的識別引出了一組稱為CRISPR的同源基因和相關(Cas)基因的識別，它們共同組成了CRISPR位點。受到病毒感染插入CRISPR-Cas的細菌基因組表明，CRISPR-Cas可能提供對噬菌體的抗性，并能通過插入或刪除間隔噬菌體序列，使感染的抗性增強或減弱。

Jinek等[3]在2012年首次證明了CRISPR- Cas系統可以產生成熟的CRISPR RNA (crRNA)和堿基對反式激活crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)，共同形成雙RNA雜交結構。這種雙RNA結構能夠將CRISPR相關蛋白Cas9引致特異性DNA序列，并在目標DNA中產生雙鏈斷裂[2]。2013年，Cong等[6]及Mali等[7]分別利用CRISPR/Cas9系統成功編輯了人EMX1、PVALB、PPP1R12C基因和小鼠Th基因的DNA序列。這是首次展示了CRISPR-Cas9系統編輯真核細胞基因組的能力。此后，大量的研究提高了基因編輯工具CRISPR/Cas9在不同物種中的特異性、正交性和多樣性，并促進了其在生物組學中的應用和發展。

CRISPR/Cas9技術在動物模型的生成、基因功能研究、多路復用突變和染色體重排等方面得到了快速的推廣和應用。與MNs、ZFNs、TALENs等傳統編輯工具相比，CRISPR/Cas9技術具有成本更低、效率更高、更加簡單的優點。

2 在胰腺癌研究中的應用進展

2.1 胰腺癌中CRISPR/Cas9的基因編輯 同源引導RNA可以引導Cas9核酸酶靶向基因組中的特定位點。當Cas9被引導到目標DNA序列，并且下游有一個前間隔序列相鄰模體(protospacer adjacent motif，PAM)序列時，它將在該位置切斷基因組的兩條鏈。然后，細胞利用兩種不同的機制修復斷裂：(1)利用非同源末端連接修復途徑進行不精確地修復，這會導致堿基的插入或刪除；(2)通過同源導向修復途徑進行準確地修復。基于現有的同源DNA序列，同源導向修復途徑可以通過介導DNA序列交換過程，將提供的DNA序列作為修復序列插入到相匹配的斷裂DNA中，從而準確修復DNA損傷。因而CRISPR/Cas9的敲除或敲入可通過誘導非同源末端連接或通過同源導向修復，刪除、替換或添加基因序列來實現[8]。

CRISPR/Cas9系統在胰腺癌研究中被廣泛用于敲除與疾病進展相關的基因。2018年Watanabe等[9]利用CRISPR/Cas9在人類胰腺導管腺癌細胞系中敲除了KDM6A基因，從而證明了KDM6A缺乏的細胞系呈現出高侵襲性的表型。2018年Pessolano等[10]及2016年Belvedere等[11]表明，在Mia PaCa2細胞系中利用CRISPR/Cas9定向敲除ANXA1基因，產生細胞外囊泡分泌變少和運動減弱的表型。Barkeer等[12]研究團隊在敲除Capan1細胞系中的GALNT3基因后發現，細胞形成的微球體變少，并喪失了細胞自我更新、遷移的能力。2018年Chugh等[13]利用CRISPR/Cas9技術，將C1GALT1從PDAC細胞中敲除，發現細胞的生長、遷移、成瘤、轉移、Tn 和sTn的表達增加。由此可見，敲除胰腺癌細胞特定基因相同策略的研究有很多，并且均觀察到了不同表型的變化。總而言之，這些研究表明，CRISPR/Cas9是一種非常強大的基因編輯工具，可以用來探索胰腺癌的基因信號通路、增殖、遷移、侵襲和潛在的化療耐藥。通過利用CRISPR/Cas9技術敲除靶基因，觀察其產生的表型變化的特點，我們可以更好地了解靶基因的生物學功能，識別胰腺癌潛在的治療靶點或更好的治療策略。而要使CRISPR/Cas9技術成為一種有效的臨床治療策略，還有很長的路要走。

近些年來，CRISPR/Cas9的基因敲除在探索腫瘤發生和發展方面也很重要，也常用于構建特異性基因表達的干細胞和動物模型，我們總結了2017-2019年的相關研究，見表1。盡管CRISPR/Cas9程序復雜，并且需要大量時間，但在胰腺癌的研究中，構建基因表達載體，并通過反轉錄病毒或慢病毒，將載體轉譯到細胞中從而生成特異性基因表達的細胞仍然很常見。

表1 使用CRISP/Cas9技術對胰腺腫瘤細胞基因敲除功能基因的研究相關

2.2 CRISPR在胰腺癌中的聯合文庫篩選 使用sgRNA(small guide RNA，sgRNA)文庫進行功能缺失表型篩選是在特定生長條件下識別蛋白質新功能的一個有效方法。而CRISPR整合文庫篩選的主要策略則是在一個CRISPR整合文庫中包含數千個質粒，每個質粒帶有一個特定靶基因的sgRNA。首先sgRNA需要通過慢病毒或反轉錄病毒轉導進入足夠數量的細胞，將被轉導的細胞放在特定條件下培養，以便篩選出所需的表型。篩選后，分離、提取出細胞中的基因組DNA，并進行下一代測序。然后，將NGS數據映射到一個預編譯的庫中，其中包含基因特異性的gRNAs(guide RNAs，gRNAs)，并使用基于模型的全基因組CRISPR-Cas9敲除分析(model-based analysis of genome-wide CRISPR-Cas9 knockout，MAGeCK)等計算工具分析結果。最后，通過將對照組與所選gRNAs進行對比，識別與所觀察到的表型相關的基因。

目前，已有一些研究在胰腺癌細胞中使用了CRISPR聯合文庫篩選。2019年，Bakke等[38]用人類sgRNA文庫轉染PANC1-Cas9細胞，并利用100nM的吉西他濱條件培養細胞6 d以進行篩選。在比較了吉西他濱選定樣本和對照樣組樣本的NGS結果后，PSMA6被確定為最佳靶點并繼續實驗發現，抑制PSMA6可導致細胞凋亡和橢球體形成減少。2017年，Steinhart等[39]將TKO gRNA文庫導入HPAF-Ⅱ-Cas9細胞，并在不同時間點篩選細胞，以確定細胞增殖所需的基因群。他們利用BAGEL算法計算每個基因的對數拜耳因子(log Bayer factor， BF)。這一分析確定了Wnt信號通路的幾個核心成分，包括WLS、CTNNB1、TCF7L2、LRP5、PORCN，以及3個FZD受體，以及HPAF-Ⅱ增殖所必需的編碼基因FZD5、WNT7B、WNT10A。隨后，這些結果在AsPC-1和PaTU8988S細胞系中得到驗證，并確定Wnt通路是胰腺癌細胞增殖的重要介質。這些篩選的結果也表明, RNF43突變的PDAC細胞的生存、增殖均選擇性依賴Wnt-β-catenin信號。之后，在PATU8902和PATU8988T兩種細胞系中進行了基因組規模的CRISPR-Cas9敲除篩選，通過敲除以確定在MAPKi環境下能夠促進增殖或生存的基因[40]。他們將GeCKOv2文庫轉入PATU8902細胞，將Avana文庫轉入PATU8988T細胞。使用100 nM 的MEK1/2抑制劑曲米替尼處理PATU8902細胞，使用10 nM的曲米替尼處理PATU8988T細胞。兩種細胞系在經過14 d的處理之后，分離基因組DNA并進行下一代測序。通過比較分析確定了CIC和ATXN1L，并通過在體實驗表明，CIC和ATXN1L的缺失均可降低曲美替尼治療的敏感性[41]。

這些研究成功地證明了在特定選擇條件下利用CRISPR聯合文庫篩選可以識別新的基因功能，從而為識別胰腺癌細胞的治療漏洞提供了一種非常強大的方法，并為新的治療策略指明了方向。但也有特殊因素會影響篩選結果的準確性，根據文庫的大小不同，需要轉換不同數量的細胞來維持庫的覆蓋率。削弱選擇條件可能提供更全面的結果，但同時也會產生假陽性，而并不完全是由表型變化所引起。不同的選擇方法也可能導致實驗的可變性。深度測序質量和數據分析工具的選擇也將在篩選準確性方面發揮非常重要作用。因此，實驗結果仍然需要使用正交方法進行驗證。

2.3 CRISPR/Cas9基因治療胰腺癌的現狀 在胰腺癌的基因治療方面，當前的研究進展包括基于基因的腫瘤細胞對化療的增敏、免疫接種和過繼免疫治療[42]。但近年來，由于其安全性和有效性，CRISPR/Cas9基因組編輯方法已在多個胰腺癌研究中得到應用。CRISPR/Cas9基因治療在體內、體外都有潛在的應用前景。在體外治療中，細胞從體外分離并修飾，然后再移植回體內。在體內治療中，基因材料可以直接注入體內。2015年Chiou等[43]通過逆行胰腺導管注射腺病毒Cre和慢病毒Cre載體建立了體內胰腺癌模型，這項技術可以為胰腺癌的治療提供新的方法。因此，CRISPR/Cas9技術為單基因疾病、退行性疾病和HIV感染的治療帶來了巨大的希望，并且已經進行了多次CRISPR/Cas9的臨床試驗。然而CRISPR/Cas9技術用于胰腺患者的治療仍有很長的路要走，仍尚存一些問題亟待解決，例如，哪個關鍵基因應該作為靶標?為了滿足臨床應用的需要，其準確性、效率和安全性如何提高？

CRISPR/Cas9不僅應用于胰腺癌的研究，還被廣泛應用于其他癌癥研究中，進而加深了我們對疾病進展的理解，耐藥機制的識別，并發現潛在的治療漏洞。然而，在臨床應用CRISPR/Cas9之前，該技術仍有一些局限性需要認清。潛在的脫靶效應是一個不容忽視的問題，需要提高技術水平，盡量減少此類狀況發生，以確保安全。目前，為減少偏離目標的影響，諸多團隊已經作出了很大的努力。2013年，Ran等[44]將D10A突變的切口酶Cas9 (Cas9n)與一對與目標位點相對鏈互補的偏置sgRna結合。該方法在不犧牲目標切割效率的前提下，提高了CRISPR/Cas9編輯的特異性。2014年，Shen等[45]在小鼠成纖維細胞中，利用Cas9(D10A)、Cas9(H840A)進行AR-A和AR-B基因編輯，并采用T7EN裂解法和TA克隆法檢測AR基因的修飾，未發現脫靶效應。2014年Tsai等[46]證明二聚體RNA引導的FokI核酸酶(RNA-guided FokI Nucleases，RFNs)可以識別擴展序列并高效編輯內源基因。

綜上所述，針對當前臨床對胰腺癌患者治療的現狀，CRISPR/Cas9正作為一種全新的工具和治療手段正在被逐漸開發出來。在國內外諸多學者的研究中有了一定的成果，為下一步的研究指出了潛在的方向。而當前CRISPR/Cas9技術仍有一定的局限性，僅限于基礎研究領域，距離臨床應用還有一定的距離，許多問題都值得科研人員在后續的工作中去探討和完善。