基于網絡藥理學的忍冬藤抗類風濕關節炎作用機制研究＊

郭思琦，姜春燕，張百霞＊＊

（1. 河北大學中醫學院 保定 071002；2. 中國藥科大學中藥學院 南京 211198）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種病因未明的以滑膜炎和血管翳為主、以對稱性關節炎為主要臨床表現的異質性、系統性的慢性自身免疫功能障礙性疾病[1]。RA 在我國發病率約為0.32%-0.37%，多見于中年女性[2]。RA 不但影響身體的運動系統，還會累及心臟、腎臟、呼吸等系統，嚴重影響人們的正常生活和工作[3]。

根據RA 的臨床表現，中醫將其歸為“痹癥”。痹癥主要由于風寒濕等邪毒侵入，引起經絡阻塞，氣血不暢所致。藤類藥物有通經入絡功效，常用于臨床治療多種風寒濕痹。忍冬藤為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥莖枝，味甘、寒，歸肺、胃經，具有清熱解毒，疏風通絡的功效[4]。《本草綱目》記載忍冬藤“治一切風濕氣及諸腫痛”，《履巉巖本草》記載忍冬藤“治筋骨疼痛”。現代數據統計和挖掘分析表明，忍冬藤為醫家治療RA 的常用藥物。如分別對國醫大師劉祖貽[5]、馬文輝[6]、王慶國教授[7]治療RA 臨床經驗數據進行統計分析，發現三位醫家治療RA 的高頻次藥味均包含忍冬藤。現代藥理學研究表明，忍冬藤被廣泛應用于風濕、類風濕和痛風等疾病的治療[8-10]。

網絡藥理學，是從生物網絡的角度研究疾病的發生發展過程、認識藥物與機體的相互作用，并指導新藥發現的學科[11-12]。其基本思想是研究疾病狀態下的生物網絡，而非與疾病相關的個別基因或蛋白，從而達到綜合的防治效果。網絡藥理學方法能夠從中藥調控的整體生物網絡層面進行分析，融合了海量的生物學和中醫藥領域的數據和技術，并利用網絡分析技術，同時具有快速高效的特點，因此該方法被越來越廣泛的應用到中藥作用機理解析中[13-15]。目前，利用網絡藥理學探討RA 的發病機制已有大量研究，但忍冬藤治療RA 的作用機制還未見系統解析與報道。本研究基于實體語法系統，構建忍冬藤治療RA 的生物網絡，以推斷化學成分作用靶點與RA 相關靶點蛋白的作用關系，從而辨識忍冬藤治療RA 的有效成分，解析忍冬藤治療RA的作用機制。

1 數據與方法

1.1 數據來源

忍冬藤的化學成分數據：來源于TCMSP 數據庫和TCMD 數據庫，以藥代動力學（ADME）參數確定藥物口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選條件，篩選化學成分。并利用CNKI 和PubMed 中的文獻（1979-2019 年）進行補充。利用Chemical Book、愛化學數據庫對所得化學成分名稱進行規范，共得到化學成分54個。

化學成分作用靶點蛋白數據：來源于Stitch 5.0（http://stitch.embl.de./），以化學成分名稱為檢索條件，置信度為0.400，數據來源于文本挖掘、共表達、基因融合等8種方法。

RA 相關靶點數據：來源于GAD 數據庫，共得到185個疾病靶點。

生物學反應及信號通路數據：來源于Reactome 數據庫（http://www.reactome.org）。Reactome 包含了人類的6792 個復合物、7327 個蛋白質，共1522 個生物學反應、7075 個反應以及各種生物分子的亞細胞定位信息。本課題組前期通過對原始下載數據的提取，得到了用于建立模型的數據，包括蛋白質、大分子復合物、小分子和生化反應的編號和名稱。

小分子代謝數據：來源于文獻“The Edinburgh human metabolic network reconstruction and its functional analysis”[16]，該文獻提供的數據收集了KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）[17]和HumanCyc（http://www.humancyc.org/）[18]數據庫中的小分子代謝反應的相關數據。

1.2 基于實體語法系統的“忍冬藤化學成分-化學成分靶點-RA疾病靶點”生物網絡構建

實體語法系統（Entity Grammar System，EGS）是針對復雜系統建模提出的一種形式化語法系統，可用來描述復雜系統的組成單位、組織方式和變化規律[19]。EGS用五元組G=（VN,VT,F,P,S）表示，其中各項分別表示非末端字符集，末端字符集，操作子集，規則集，初始字符。當不考慮或者不區分末端字符與非末端字符時，用四元組G=（V,F,P,S）表示，其中V=VN∪VT。操作子集F 的每一個元素表示字符的組織方式，字符采用這種組織方式所形成的單元E（V, F）叫實體。四元組分別對應于復雜系統建模的四個方面，即基本組成單位、復雜系統中的基本結構、由結構所組成的實體轉換規則以及由基本組成單位按照結構類型組成的特定實體。實體語法系統可以由特定的實體出發，根據特定的轉換規則進行推演得到新的實體。

本研究將實體語法系統用于忍冬藤化學成分靶點，作用于RA 相關靶點的生物網絡構建和中藥作用效應在背景網絡中的傳遞和推演，V 主要包含組成忍冬藤作用生物網絡的節點類型，包括中藥化學成分及其作用靶點，疾病名稱以及相關蛋白靶點，復雜小分子和蛋白等；F 包括網絡中節點關系類型以及為后續推斷過程所準備的虛擬實體類型；P 所包含的規則用于忍冬藤作用靶點與RA疾病靶點關系的推斷；F包括網絡中的各種節點關系類型（interaction，neg，pos 等），通過以上原理來進行忍冬藤作用機理的解析。推理規則如下：

1.3 網絡可視化

Cytoscape 是一個基于Java 技術的開放源代碼的網絡可視化軟件平臺，主要用于復雜生物網絡的構建和分析[20]。本研究利用Cytoscape 3.7.1 繪制生物網絡圖，展示forward(C,D,F,M)中的生物分子。在生物網絡中，“節點（node）”表示化學成分、靶蛋白、以及其他小分子，“邊（edge）”表示化學成分與靶點之間的關系。

表1 忍冬藤治療RA的有效成分

1.4 拓撲結構分析

網絡拓撲結構用于表示整個網絡的結構外觀，反映各結點之間的結構關系。本研究利用Cytoscape

3.7.1 軟件中CytoNCA 插件進行拓撲結構分析，以degree 值、betweenness 值、closeness 值大于其平均值的節點為指標進行篩選，得出網絡關鍵節點，即忍冬藤治療RA的關鍵作用靶點。

1.5 網絡富集分析

David是一種整合多種數據庫資源的數據庫，運用改良的Fisher精確檢驗算法實現對基因集的富集分析。本研究利用DAVID 6.7 Functional Annotation Clustering中Gene Ontology 的分子功能條目對關鍵蛋白的生物過程（BP）進行KEGG 通路富集分析[21]。選擇P＜0.05和FDR ＜0.05的條目作為顯著富集的通路，即忍冬藤治療RA的生物通路。

2 結果與分析

2.1 忍冬藤化學成分作用于RA相關靶點的生物網絡

本研究建立了忍冬藤、RA 相互作用的生物網絡，以忍冬藤中所有化學成分為起點，RA 為終點，將忍冬藤的化學成分與RA 的相關蛋白連接，深入探討忍冬藤抗類風濕關節炎的作用機制，忍冬藤化學成分作用于RA 相關靶點的生物網絡（見圖1），共包括2 289 個節點和5 278 條邊。生物網絡中，紅色菱形代表忍冬藤治療RA 的有效化學成分，包括：木樨草素、綠原酸、蘆丁、芳樟醇、棕櫚酸、丁香酸、槲皮素等31 個化學成分；綠色圓形代表化學成分的靶點蛋白；藍色正方形代表網絡中的小分子復合物；橙色三角形代表網絡中的小分子；黃色平行四邊形代表生物化學途徑。灰色的邊代表忍冬藤中某化學成分對其相關靶點為促進作用，黑色的邊代表抑制作用，粉色的邊代表未知的相互作用關系。

2.2 忍冬藤治療RA的有效成分

將生物網絡中能通過一條或多條生物途徑作用到RA相關靶點的化學成分作為忍冬藤治療RA的有效成分，最終得到包括木樨草素、綠原酸、蘆丁、芳樟醇、棕櫚酸、丁香酸、槲皮素等在內的31個有效成分（見表1）。

木樨草素[22]和咖啡酸[23]均具有抗炎、免疫調節作用，可調節免疫應答、影響炎癥反應及調控細胞生長，在控制類風濕關節炎病程進展中發揮抗炎、抗免疫作用，減輕類風濕關節炎惡化；Li等[24]曾建立膠原誘導關節炎（CIA）小鼠模型，得出芹菜素可通過抑制滑膜增生、血管生成和破骨細胞生成來抑制CIA，從而實現對RA 的保護作用；蘆丁可通過抑制NF-κB 信號通路降低氧化應激和促炎細胞因子，從而抗RA[25]。槲皮素可減少RA 軟骨細胞基質降解和細胞凋亡，可抗骨內細胞衰老，從而預防和治療骨關節破壞，在多種關節疾病中均有保護和治療作用[]。丹皮酚具有明顯的抑制滑膜組織炎癥反應和RA 進展的作用，潛在機制可能是 通 過 衰 減TLR4-NF-κB 激 活 實 現[29]。Somaiya Mateen等[30]發現外周血單個核細胞（PBMC）培養中，發現丁香酚對RA患者的PBMC培養具有明顯的抗炎、抗氧化作用。由此可見，本研究得到的忍冬藤抗RA 的有效成分具有一定可靠性。

2.3 忍冬藤治療RA的關鍵疾病靶點

利用CytoNCA 插件對網絡進行拓撲結構分析，取Degree 值、Betweenness 值、Closeness 值大于其平均值的節點，包括CYP17A1、CYP8B1、POMC、CYP19A1、

AKT1、 CYP1B1、 MAPK1、 AKR1B1、 JUN、 SP1、BHLHE39、CYP1A1、PPARA 共計13 個，為忍冬藤治療RA的關鍵靶點（見表2）。

圖1 忍冬藤化學成分作用于RA相關靶點的生物網絡

經文獻調研發現，本研究得到的13個忍冬藤治療RA 的關鍵靶點蛋白均與RA 有關。例如，腦內p-內啡肽在中樞中分布廣泛，具有較強的嗎啡樣活性，對RA有較強的鎮痛作用。POMC（阿黑皮素原）為腦內p-內啡肽的前體物質，因此POMC 表達水平越高則鎮痛效果愈加顯著[31]。另外，RA 是一種自身免疫疾病[32]，促腎上腺皮質激素是一種可調節免疫系統中大多數細胞，對神經、免疫、內分泌系統均有調節作用的激素，POMC 是促腎上腺皮質激素的前體物質，因此POMC表達水平越高則免疫調節能力越好。破骨細胞是導致RA骨破壞的主要原因之一[33]，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路活化是破骨細胞形成的關鍵通路[34]，抑制p38 MAPK信號通路可減少破骨細胞分化，減輕動物實驗性關節炎進程和關節損傷[35]。綜上所述，本研究得到的忍冬藤抗RA的關鍵靶點具有一定可靠性。

2.4 忍冬藤治療RA的關鍵通路分析

本研究對表2 中13 個關鍵靶點進行富集分析，共得到55條通路（見表3）。

表2 忍冬藤治療RA的關鍵靶點蛋白

富集分析所得生物通路大致可分為：激素調節、脂質代謝調控、細胞周期及凋亡調控、促肝臟發育四方面。從動物、人類流行病學統計的數據發現，RA 發病高峰期與絕經期相吻合，這提示雌激素缺乏可能是RA 的發病原因之一[36]。實驗研究表明，接受卵巢切除（OVX）降低雌激素水平的小鼠，與接受雌激素治療的OVX 小鼠或者未接受OVX 的正常雌激素水平小鼠相比，關節炎發生率高且病情更嚴重[37]。早在十五年之前，便有研究發現激素替代療法可減少紅細胞沉降率、血清血紅蛋白水平升高、增加骨密度，使關節糜爛進展減慢，臨床療效改善，同樣證明激素水平在RA 病程中必須給予關注[38]；另有臨床研究表明，雌激素可在一定程度上抑制破骨細胞活性，促進成骨細胞增殖[39]。綜合上文可知，本研究通過富集分析所得激素的調節、代謝相關通路GO：0034754、GO：0042445、GO：0010817、GO：0009725可能是忍冬藤治療RA的生物通路。

Andonian Brian J等[40]發現，肥胖或超重的RA患者比體重正常的RA 患者滑膜炎更嚴重；Ferguson Lyn D等[41]以腰圍為指標評判中心性肥胖與RA的聯系，發現中心性肥胖會增加RA 患病率。脂質攝入過多會導致肥胖、脂肪酸代謝途徑、類固醇的代謝過程均會調控肥胖，從而影響RA 發病率。由此可知，類固醇代謝過程（GO:0008202）、對脂多糖的反應（GO:0032496）、脂肪酸-氧化的調節（GO:0031998）、調節脂質分解代謝過程（GO:0050994）、脂肪酸氧化的調節（GO:0046320）、脂類生物合成的過程（GO:0008610）、脂質代謝過程的正向調控（GO:0045834）、脂肪酸代謝過程的調節（GO:0019217）均為忍冬藤治療RA的關鍵生物途徑。

RA 屬風濕痹癥，系肝腎虧虛、精血不足、筋骨失養所致。根據中醫基礎藏象學說，肝主疏泄、主藏血，包括肝、膽等臟器[42]。另外，肝臟化學成分異常、肝纖維化經常出現在RA 病程中。因此，肝臟發育（RAGO:0001889）是忍冬藤治療RA的一條潛在的生物途徑。

RA 為慢性疾病，發病時伴有關節損傷和骨質破壞，在RA 的病程中，破骨細胞分化和破骨細胞相關蛋白的上調會導致關節被侵襲和破壞[43]。可分化為破骨細胞的前體包含單核細胞、巨噬細胞、DCs（不成熟樹突狀細胞）及MDSCs（骨髓來源的抑制性細胞），而細胞分化涉及基因表達、轉錄、蛋白質翻譯等過程，因此細胞生物合成過程的正向調控（GO：0031328）、蛋白質運 輸（GO：0017038）、基 因 表 達 的 正 調 控（GO：0010628）可能是忍冬藤治療RA的相關生物通路。

有研究[44]發現，miRNA 的異常表達與滑膜細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移關系密切，參與RA 炎癥反應、免疫反應、敏感性和骨破壞，調控細胞信號通路和細胞外基質降解，是RA 的潛在診斷標志物和治療靶點。因此，細胞凋亡的正向調控（GO：0043065）、細胞死亡的正調控（GO：0010942）也可能是忍冬藤治療RA 的生物通路。

綜上所述，已有相關報道的和RA 相關的生物通路共涉及四個方面，說明忍冬藤可通過48條生物通路治療RA。目前，本研究還不能確定其他7條生物通路是否是忍冬藤治療RA的生物通路。

3 結論與展望

忍冬藤是治療風濕痹癥、抗RA 的臨床常用藥，本研究基于“實體語法系統”構建忍冬藤抗類風濕關節炎生物網絡，探討忍冬藤抗RA 的有效成分和作用機制。不同于蛋白質互作網絡[45]，本研究所構建的生物網絡包含蛋白、基因、小分子代謝物等人體內所有小分子類型，使網絡模型具有更高的仿真能力。

本研究通過對忍冬藤抗類風濕關節炎生物網絡的分析，辨識出忍冬藤抗RA的31個有效成分，包括木樨草素、芹菜素、蘆丁、槲皮素、丁香酸等。忍冬藤的31 個 有 效 成 分 作 用 于CYP17A1、CYP8B1、POMC、CYP19A1 和AKT1 等13 個關鍵靶點，通過以下五點發揮作用：①激素調節影響破骨細胞的活性；②脂質、脂肪酸代謝途徑影響體脂率；③調控轉錄和翻譯過程影響細胞分化成破骨細胞；④調控RNA的表達和細胞凋亡，影響免疫反應、炎癥反應；⑤調節肝臟發育，從而發揮治療類風濕性關節炎的作用。

通過文獻調研發現，大部分有效成分具有抗RA作用，大部分生物通路為忍冬藤治療RA 的生物通路，這說明基于網絡藥理學探討忍冬藤抗RA 的有效成分及作用機制具有可靠性。但是，有些化學成分的抗RA作用以及少部分生物途徑（如GO:0055114、GO:0010557）是否和RA相關還未見報道。

隨著網絡藥理學相關技術和數據庫的發展，本研究將構建包含機體內所有生物分子類型的動態生物網絡，提高生物網絡的仿真能力。本課題組將進一步驗證本次研究得到的有效成分是否為忍冬藤抗RA 的有效成分，為抗RA 的新藥研發奠定基礎；將明確7 條生物通路是否是忍冬藤治療RA 的生物通路，為RA 發病機制研究提供依據。