艾煙對弱精子癥模型大鼠精子參數和血清性激素的影響＊

安 雨，劉雅潔，邢國剛，金滋潤2，，西 珂2，，霍涌瑋，趙百孝

（1. 北京中醫藥大學針灸推拿學院 北京 100029；2. 北京大學神經科學研究所 北京 100191；3. 北京大學基礎醫學院神經生物系 北京 100191；4. 西安交通大學醫學部基礎醫學院人體解剖學與組織胚胎學系 西安 710061；5. 北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029）

弱精子癥（Asthenozoospermia）是引起男性不育癥的常見病因之一，以精子活力下降為主要表現[1]，弱精子癥患者的精液參數指標表現為快速前向運動的精子比例與慢速前向運動的精子比例之和，即A+B 級精子數小于50%，或A級精子數小于25%[2]。隨著現代社會的發展，多種多樣的污染增加，生活、工作壓力大，以及隨之而來的生育年齡的推遲，不育癥的發病率越來越高[3-4]。流行病學顯示，全球有10%-15%的適齡夫妻被不育癥困擾，其中男性因素占到了50%[5]。目前，中西醫針對弱精子癥的研究取得了一定成效，但還是有部分患者的療效不能令人滿意[6]，治療弱精子癥還需要更加多樣、有效的方法。本課題組前期研究發現，臨床診室濃度的艾煙，對正常Wistar大鼠的生殖機能不僅無害而且還有促進作用[7]，具體表現為可以提高大鼠的精子濃度、精子活力、精子活率，提高大鼠血清總睪酮、游離睪酮、睪酮分泌指數。本研究擬使用生殖毒性藥物奧硝唑灌胃建立弱精子癥大鼠模型，觀察艾煙對弱精子癥模型大鼠生殖方面的影響，以達到為治療男性弱精子癥提供新思路的目的。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

奧硝唑（北京華威銳科化工有限公司），羧甲基纖維素鈉（百奧百樂生物科技有限公司），普通清艾條（長20 cm，直徑2 cm，湖北李時珍中藥飲片有限公司），市售香煙（雙喜牌，焦油含量11 mg/支），玻璃缸（自制，80 cm× 80 cm × 60 cm，玻璃壁上設有硬幣大小的圓孔），光散射式數字粉塵測試儀（北京賓達綠創科技有限公司），精子計數板（南寧松景天倫生物科技有限公司），水浴鍋（北京市長風儀器有限公司），計算機輔助精子分析系統（北京偉力新世紀科技發展有限公司，型號：WLJY-9000），普通光學顯微鏡，臺式冷凍離心機（型號：5417R，eppendorf）。睪酮（T）及促黃體生成素（LH）Elisa試劑盒（北京百諾威生物科技有限公司）。

1.2 動物分組、實驗

32 只成年雄性SD 大鼠，體質量200-230 g ，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0006。將大鼠按體重隨機分為4組：溶劑對照組（vehicle 組）8 只、模型組（ORN 組）8 只、艾煙治療組（ORN+MS組）8只、香煙對照組（ORN+CS組）8只。適應飼養7天，期間大鼠均自由食水，每天換水，兩天換一次墊料，保持鼠籠清潔干燥。飼養環境溫度維持在22℃±2℃，相對濕度50%-60%，保持光照12h（8:00-20:00）和黑暗12h（20:00-次日8:00）交替。

制備奧硝唑溶液：先配制0.2%羧甲基纖維素鈉溶液：0.2 g羧甲基纖維素鈉，加100 mL滅菌雙蒸水，同時加兩滴100 μL Tween-20，攪拌均勻后即可；再將0.25 g奧硝唑加1 mL的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液，置于干凈研缽中研碎至糊狀，奧硝唑溶液配制完成。

模型組、艾煙組、香煙組：每組均使用奧硝唑溶液灌胃，每次400 mg/kg，每日1次，連續灌胃10天。從第11 天起，將三個組的奧硝唑劑量調至200 mg/kg，每日1 次，并開始艾煙和香煙干預，每天20 min，每日1 次，每周6天。實驗共8周。

溶劑對照組：只給與等體積的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，每日1次，共灌胃8周，不進行其他干預。

艾煙濃度的控制：先用粉塵測試儀測量京津地區夏季臨床艾灸場所PM10 濃度，再將艾條通過圓孔插入玻璃缸內，再用該粉塵儀檢測玻璃缸中艾煙，當濃度達到3倍臨床艾煙濃度時，將一整組大鼠連同鼠籠一起放入玻璃缸干預。香煙濃度與艾煙濃度保持一致。

1.3 標本采集與檢測

各組大鼠在治療結束后24h，用水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血，放血處死實驗動物，并迅速摘取睪丸、附睪，備用。

血液標本采用ELISA 法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

采用擴散法收集附睪尾中的精子進行精子參數分析[8]。將2 mL 的0.9%氯化鈉溶液倒入標記好的一次性培養皿中，37℃水浴預熱，將雙側附睪尾放入其中，用剪刀在附睪尾輕輕地剪3刀，在37℃水浴鍋中放置2 min，輕輕混勻，取20 μL 液體加到37℃預熱的精子計數板上，隨機選6 個視野，2 min 內完成測試。使用計算機輔助精子分析系統檢測精液主要指標精子密度、精子活力、精子活率、A 級精子數、A + B 級精子數。

1.4 睪丸組織形態

取大鼠睪丸組織，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，切片厚5 μm，貼于載玻片上，室溫干燥。常規HE染色后，光鏡下觀察照相。

1.5 統計學分析

實驗結果用SPSS 20.2 統計軟件分析。所有數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，對符合正態性分布且方差齊的計量數據采用（xˉ±s）表示，用單因素方差分析ANOVA 法進行分析，若組間數據有顯著性差異，再用LSD 法進行組間多重比較。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 艾煙可明顯提高弱精子癥模型大鼠的精子質量

與溶劑對照組相比，模型組大鼠的精子質量明顯下降，包括精子活力、精子活率、A 級精子數、A+B 級精子數均顯著下降（P ＜0.01），這表明弱精子癥大鼠模型建立成功。

表1 艾煙對弱精子癥模型大鼠精子參數的影響

圖1 睪丸組織200鏡下

給予艾煙干預后，弱精子癥模型大鼠精子的各項指標均有顯著改善（見表1），具體表現為：與模型組相比，艾煙組大鼠的精子活力、精子活率、A 級精子數和A+B 級精子數明顯提高（P ＜0.01）；與溶劑組相比，艾煙組的精子活力、精子活率、A級精子數、A+B級精子數無差異（P ＞0.05）。

香煙對照組大鼠的精子質量產生了意料之外的變化，表現為：與溶劑組和艾煙組相比，香煙組的精子活力、精子活率、A級精子數、A+B級精子數顯著低下（P ＜0.01），但與模型組相比，香煙組的精子活力、精子活率、A+B級精子數有所回升（P ＜0.05）。

四個組之間的精子密度無統計學差異（P ＞0.05）。

2.2 艾煙可調節大鼠血清睪酮、促黃體生成素水平（nmol/L）

與溶劑對照組相比，模型組和香煙組大鼠的血清睪酮的含量顯著下降（P ＜0.01）、促黃體生成素的含量上升（P ＜0.01）；給予艾煙干預后，艾煙組與模型組相比，睪酮的含量上升（P ＜0.01）、促黃體生成素的含量下降（P ＜0.05），而香煙組沒有改善，效果明顯低于艾煙組（P ＜0.01）（見表2）。

2.3 大鼠睪丸組織的形態學變化

由圖1可以看出，溶劑對照組大鼠睪丸組織中，生精小管排列緊密、間隙緊湊，生精小管的生精上皮細胞完整，基底膜厚度均勻，各級生精細胞排列整齊且層次清晰，管腔內精子豐富。模型組大鼠睪丸組織中，各個生精小管間的間隙增大，生精小管管腔擴大，基底膜變薄，生精細胞的層次混亂，無法清楚分級，管腔內的精子數量明顯減少。給予艾煙干預后，生精小管的排列相對緊密，管腔也有所縮小，生精上皮和基底膜的厚度增加，各級生精細胞的排列層次也有恢復，管腔內精子數量明顯增加，與溶劑對照組相比還存在一定的差距。香煙組的病變程度比模型組更重一些，表現為生精小管的排列更為稀疏，生精小管的管腔也更大，基底膜更薄，各級生精細胞的數量顯著減少。

表2 艾煙對弱精子癥模型大鼠血清睪酮、促黃體生成素含量的影響

3 討論

弱精子癥屬于中醫學的“精冷”范圍，病機多為腎虛。其發病原因和機制較為復雜[9-10]，染色體異常、微生物感染、內分泌紊亂、精索靜脈曲張及自身免疫等因素是弱精子癥較明確的病因，氧化應激和細胞凋亡是其較明確的發病機制。

成功建立弱精子癥動物模型，是探索弱精子癥新療法和機制的前提。在臨床上，奧硝唑被廣泛用于防治術后感染和生殖系統感染[11]。國內外研究發現，奧硝唑可以影響附睪中精子的成熟和運動，從而導致雄性動物不育且這種影響是可逆的[12]，這一點正是造模的基礎，并且需要在造模成功后，不間斷給藥以維持模型的弱精子效果。有研究[13]每天用400 mg/kg 的劑量灌胃造模；也有研究[14]每天用200 mg/kg 的劑量造模。考慮到本實驗中造模及干預時間長，所以前10天用400 mg/kg，從第11 天開始，將奧硝唑的劑量減半。本實驗中的模型組與溶劑組相比，精子參數明顯下降，睪丸生精小管管腔擴大，小管之間間隙增大，生精細胞層次排列紊亂，管腔內精子數量明顯減少，其造模效果與之前的研究相似，說明弱精子癥模型制備成功。

艾灸是中醫常用的療法之一，國內外的臨床研究表明灸法治療弱精子癥療效確切，包括麥粒灸[15]、艾條灸[16]、臍灸[17]；機制研究[18]也發現，艾灸可以改善弱精子癥大鼠精子質量，可能與灸法的溫熱刺激能調節性激素T、LH、FSH 水平和細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、CytC 水平有關。艾灸通過清除自由基抗氧化[19-21]和抑制細胞凋亡[22-25]這兩大途徑，能治療包括弱精子癥在內的多種疾病。

艾灸的起效途徑[26]主要包括溫熱效應、光輻射、艾煙等。對艾葉成分的研究[27]發現，艾葉中富含揮發油（如桉油精、松油醇、1,8-桉葉油素）、黃酮（如黃酮醇及其苷）等物質，燃燒后產生的艾煙可以抗氧化[20]，抗神經元凋亡[28]，抗炎性反應[29]，調節脂質代謝[30]。由此可以提出假說，艾煙能通過從抗氧化應激和抗細胞凋亡的途徑治療弱精子癥，下一步的研究應著眼于這兩方面指標的變化。此外，艾煙作用于人體主要是經過嗅覺系統，這與中醫的芳香療法密切相關，氣味可能刺激嗅覺神經和大腦邊緣系統，今后也可以考慮切斷嗅覺通路[31]，來觀察艾煙對弱精子癥的療效。

精子密度、精子活力、精子活率、A 級精子數、A+B級精子數等必備指標常用于評價以下四個方面：男性生育能力和精子的質量、睪丸組織的損害程度、精子的發生功能、觀測雄鼠的生殖功能[18]。本實驗中，與溶劑對照組相比，模型組大鼠的精子活力、精子活率、A級精子數、A+B 級精子數均顯著降低（P ＜0.01）；經過艾煙干預后，艾煙組大鼠的這些指標均升高（P ＜0.01），這說明艾煙能明顯改善奧硝唑誘導的弱精子癥模型大鼠的精液質量。這與本課題組的前期研究[7]相一致。

精子的產生，在內分泌等許多因素下進行，過程較為復雜，如果睪丸受損，往往表現為睪酮（T）的降低和促黃體生成素（LH）的升高[18]，T/LH 的比值也是衡量患者睪丸生精水平的重要參考指標[32]。因此，血清性激素T 和LH 的水平可以反映精子的發生的情況。本實驗中，與溶劑組相比，模型組大鼠的T 降低而LH 升高（P ＜0.01），經過艾煙干預后，艾煙組大鼠的T 升高（P ＜0.01）、LH 降低（P ＜0.05），激素水平得到顯著改善。

香煙煙霧以尼古丁為主，是一種氧化劑，可直接造成生殖系統的氧化應激損傷[33]，嚴重影響精液質量，也會抑制睪酮的合成[34]，本實驗的血清激素和病理結果證實了其副作用。雖然香煙提高了精子活力、活率、A+B 級精子數，但沒有提高A 級精子數，更遠遠沒有達到像艾煙組一樣的效果，前人也有類似的發現[35]：吸煙6 周后小鼠的精子活力沒有下降反而有上升趨勢。由于香煙對生殖系統的損傷存在時長和劑量的依賴性[36]，所以本課題組猜測，香煙的刺激提高了機體的興奮性，類似于尼古丁促進中樞神經系統對信息的處理[37-38]。

本實驗的量-效關系、時-效關系還可進一步完善，如提高艾煙的濃度、設置不同濃度的分組，延長或縮短單次艾煙干預的時長，以尋找最佳濃度和最佳干預時長。

綜上所述，本課題組得出結論：艾煙可以提高弱精子癥模型大鼠的精子質量，提高精子活力、精子活率、A級精子數、A+B級精子數；提高弱精子癥模型大鼠血清睪酮水平、降低促黃體生成素水平；減輕弱精子癥模型大鼠睪丸的病變；從而保護弱精子癥模型大鼠的生殖功能，對臨床弱精子癥患者的治療具有一定的參考價值。