昆侖雪菊通過NOS/NO途徑改善高脂飲食誘導低氧環境大鼠海馬組織的損傷＊

吳 萍，張廣梅，趙協慧，李冰鵠，祝君君，趙艷霞，李 卡

（青海大學醫學院 西寧 810000）

一氧化氮（NO）是一種無機小分子化合物，兼有第二信使物質與神經遞質的功能，是信息交換的重要載體，參與生理功能的調節。如松弛血管平滑肌，抑制血小板聚集，神經傳導，細胞毒性及免疫功能等[1]，并在中樞與外周神經系統中發揮著重要的作用。血紅蛋白對NO 的活性具有抑制作用，由于某種原因導致血紅蛋白濃度增加時，也可以引起血管痙攣；NO 釋放下降可引起血小板聚集，導致血管痙攣與局部血栓形成。NO 是一種慢突觸遞質，保護腦細胞避免毒物的攻擊及腦缺血時調整腦血供應等，小量釋放可作為信使物質傳遞信息，而大量釋放時又可以殺死腦細胞，盡管外周神經系統中釋放量有限，其仍符合作為經典遞質的許多標準，但同時NO 并非儲存在突觸顆粒中；以擴散的方式到達靶細胞，受體是GC 的活性位點上的鐵離子，腦組織不同部位分布著一氧化氮合酶（NOS），尤其以海馬、小腦等部位為主，NOS 在腦內的分布并不完全與GC 分布相符，因此，NO 可能還通過其它途徑發揮作用這也是其相對不典型性的體現。超氧化物歧化酶（SOD）通過清除超氧陰離子自由基，保護細胞，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用[2]，丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應的產物，其含量的多少可以反映組織的脂質過氧化反應的速度和強度[3]。NO、MDA、SOD、NOS 等因子均在缺血缺氧引起組織損傷中占有重要地位，且NO、MDA 含量與SOD 活力及NOS mRNA 表達的測定，均可從不同水平及角度反映組織損傷程度。

由于社會生活條件大幅度改善，人們普遍缺乏運動，體內低循環代謝加上高熱量高脂肪飲食，工作和生活壓力對精神的影響，使得老年心腦血管疾病發生的風險性增高。血脂代謝的異常可引發脂類物質在血管內的沉淀，從而導致動脈粥樣硬化、血小板聚集異常，心腦血管疾病的致病率增高。尤其是對于中老年來說，一旦引發心腦血管疾病后，僅依靠單一的藥物治療往往無法達到滿意效果，很難治愈。近年來，隨著前往高原地區的低海拔地區旅游人群數量不斷增加，更多的人受到低氧的影響。對于高原人群，低壓低氧對機體組織器官的功能、代謝等產生著廣泛的影響，且單純慢性低氧即可引起高脂血癥。同時，高原低溫低氧的特點，也使高原人群飲食習慣改變，高脂飲食現象普遍增多，高脂血癥的發生率增加。使低氧環境人群暴露于高脂血癥的威脅增多。高原低氧環境對大鼠海馬組織具有損傷性，機制可能與一氧化氮合酶/一氧化氮（NOS/NO）異常有關，主要表現為誘導型NOS（iNOS）表達增加，iNOS在缺血缺氧中起損害作用[4]。但高脂飲食對低氧環境機體海馬組織的影響尚不清楚。昆侖雪菊中主要含有氨基酸、蛋白質、糖類、黃酮類、生物堿、有機酸、酚類、蒽醌類及香豆素類等，具有抗氧化損傷、血管保護等多種作用[5]。因此，本課題選用昆侖雪菊干預低氧與低氧聯合高脂飲食的大鼠，通過測定實驗大鼠海馬組織SOD 的活力、MDA 的含量、海馬區一氧化氮合酶表達、NO 含量的變化和海馬病理，探討高脂飲食對低氧環境大鼠海馬的影響及昆侖雪菊干預在NOS/NO 途徑中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD 大鼠40只（體重200.0±20.0 g），購于西安交通大學醫學部實驗動物中心（許可證號：SCXK（陜）2012-003），適應性飼養一周。將40只實驗大鼠隨機分為4 組分別為：低氧對照（H）組、低氧高脂飲食（HH）組、昆侖雪菊干預低氧（XJH）組、昆侖雪菊干預低氧高脂飲食（XJHH）組。

1.2 儀器與試劑

低壓氧艙室（貴州風雷航空機械有限公司，DYC-3000），LightCycler?96（瑞士，Roche），冷凍離心機（德國，BECKMAN），高速組織勻漿機（德國，Miccra D-8）。一氧化氮（NO），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物公司），OLYMPUS光學顯微鏡BC35，核酸逆轉錄儀（Eppendrof 6325-PCR儀）。

1.3 實驗過程

將各組實驗大鼠置于模擬海拔5000 m 的低壓氧艙中，每天8:00am四組分別給予生理鹽水、脂肪乳劑、生理鹽水、脂肪乳劑；8:00pm分別給予生理鹽水、生理鹽水、昆侖雪菊提取液、昆侖雪菊提取液。灌胃劑量均為1 mL/100 g。實驗周期為1周。

1.4 昆侖雪菊液的制備

昆侖雪菊干燥花（青海省有理堂農牧科技有限公司，許可證號：JY16301030012728）粉碎取26.8 g,將雪菊花粉置于1000 mL 的燒杯中，加開水浸泡30 min,取上清液，再次沸水浸泡30 min,取上清混勻，靜置于4℃冰箱中沉淀濃縮藥液達53.6 mg/mL。于4℃冰箱保存。

1.5 脂肪乳劑制備

取豬油25 g放入200 mL燒杯內，于磁力攪拌器上加熱至100 ℃，加入膽固醇10g，溶化，再加入丙基硫氧嘧啶1 g，然后加入25 g 吐溫80，充分攪勻制成油相。取另一200 mL 燒杯中加入蒸餾水30 mL 和丙二醇20 mL，加熱至60℃，然后加入脫氧膽酸鈉2 g，充分攪拌至完全溶解制成水相[6]。然后油相與水相混勻，放4℃冰箱中待用。

1.6 標本制備

20%烏拉坦按照0.5 mL/100 g 進行腹腔注射麻醉大鼠，解剖取海馬組織，將部分海馬組織放入4%多聚甲醛溶液固定，用于組織形態學觀察，其余放入凍存管，-80℃冰箱保存備用。

1.7 指標測定

取凍存海馬組織采用BCA 法測定組織蛋白濃度，TBA 比色法檢測丙二醛含量,WST-1 法檢測超氧化物歧化酶活力，硝酸還原酶法檢測硝酸鹽/亞硝酸鹽（NOx）水平，均按照試劑盒步驟操作并計算。

圖1 大鼠大腦海馬區組織形態學變化（放大倍數×400）

組織NOS 表達水平測定：組織NOS mRNA 水平檢測用TRLzol RNA提取法法提取總RNA。按照Ta KaRa Fast Quant RT Kit 說明逆轉錄合成c DNA，目的基因引物序列:eNOS 上游5'-CTACCGGGACGAGGTACTGG-3'，下游:5'-GGAAAAGGCGGTGAGGACTT-3'[7]；nNOS上游:5'-GGAATATGAGGAGAAGTGTAG-3'，下游:5'-CTGAGTGAGGAGTGTAG-3'；iNOS 上游5'-TCTTTGC TTCTGTGCTAATG-3'，下 游 5'-CAGTAGTTGTTCC TCTTCCA-3'。內參基因引物序列β-actin[8]上游5'-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3'，下 游5'-GACTCAT CGTACTCCTGCTT-3'。Real-timePCR 反應體系（20 μl體系）為:2×SYBR Select Master Mix 10 μl，40 個循環。eNOS 反應條件：Holdingstage:95℃90 s，Cycling stage:95℃5 s，60℃30 s，72℃60 s；nNOS 反 應 條 件：Holdingstage:95℃120 s，Cycling stage:95℃10 s，56℃30 s，72℃60 s；iNOS 反應條件：Holdingstage:95℃120 s，Cycling stage:95℃10 s，62℃30 s，72℃60 s，每個樣品設2個復孔，目的基因與內參基因PCR反應條件一致，采集和分析數據，采用2-△△Ct法進行計算。

1.8 數據統計學分析

本研究采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計處理，采用單因素方差分析（ANOVA），組間采用LSD 比較，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 海馬組織形態學變化

大鼠大腦海馬區組織形態學變化，如圖1所示。CA1區：H組細胞結構層次排列正常緊密，胞漿深染，細胞水腫，神經元細胞胞漿疏松，有些呈空泡狀，尼氏體消失，膠質細胞輕度增生。HH 組細胞結構層次增多，排列紊亂疏松，胞漿疏松，神經元細胞重度胞漿疏松，呈彌漫性空泡狀，尼氏體消失，膠質細胞增生不明顯。XJH 組細胞結構層次排列正常緊密，胞漿深染，胞漿疏松，神經元細胞胞漿疏松，有些呈空泡狀，尼氏體存在。與XJH組相比XJHH 組細胞結構層次增多，排列紊亂疏松，胞漿疏松，神經元細胞輕度胞漿疏松，尼氏體存在。

CA3 區：H 組細胞層次結構增多，排列紊亂，見少量細胞核固縮，胞漿疏松，有些細胞胞漿呈空泡狀，神經元細胞胞漿疏松，有些細胞胞漿呈空泡狀。HH 組細胞層次結構增多，排列紊亂，胞漿疏松，有些細胞胞漿呈大小不等的空泡狀，神經元細胞胞漿疏松，有些細胞胞漿呈空泡狀。XJH 組細胞層次結構增多，排列紊亂，可見少量細胞核固縮，胞漿疏松，有些細胞胞漿呈空泡狀，神經元細胞胞漿疏松，有些細胞胞漿呈空泡狀。與XJH組相比XJHH 組神經元細胞輕度胞漿疏松，無空泡。

2.2 SOD活力、NO含量、MDA含量

SOD活力、NO含量、MDA含量檢測，如表1所示。

與H 組相比，HH 組SOD 升高（P＜0.05），MDA 降低（P＜0.05），XJH 組NO、MDA 均 明顯 升高（P＜0.05）；與HH組相比，XJHH組MDA升高（P＜0.05）；與XJH組比XJHH組MDA下降（P＜0.05）。

表1 SOD活力、NO含量、MDA含量檢測（xˉ± s）

表2 海馬組織NOS mRNA表達水平檢測（xˉ± s）

2.3海馬組織NOS mRNA表達水平

海馬組織NOS mRNA 表達水平檢測，如表2所示。

與H 組相比，HH 組iNOS mRNA 明顯升高（P＜0.05），XJH 組eNOS mRNA 降 低（P＜0.05），nNOS mRNA 升高（P＜0.05）；與HH 組相比，XJHH 組nNOS mRNA 明顯升高（P＜0.05）；與XJH 組相比，XJHH 組eNOS mRNA 升 高（P＜0.05），iNOS mRNA 升 高（P＜0.05）。

3 討論

昆侖雪菊又稱“血菊”，學名為“蛇目菊”“雙色金雞菊”，與天山雪蓮齊名。既可以作為花茶飲料，又經常被當作治療高血壓、高血脂的保健藥物。在北美地區，當地人使用昆侖雪菊治療腹痛，出血等；葡萄牙則有人當茶泡飲控制糖尿病。研究表明，昆侖雪菊成分中主要含有氨基酸、蛋白質、糖類、黃酮類、生物堿、有機酸、酚類、蒽醌類及香豆素類等，具有抗氧化、血管保護等多種作用[5]。受到廣泛關注與研究。昆侖雪菊各部位中，頂狀花序表現出最強的抗氧化能力，其抗氧化能力頂狀花序＞芽部＞種子＞葉＞莖部[9]。昆侖雪菊的提取物中含有豐富的類黃酮化合物，能夠治療鏈脲霉素引起的葡萄糖不耐受癥和改善高脂飲食引起的高血糖癥，其機理與恢復胰腺功能、調節糖代謝關鍵酶、抑制α葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性等相關[10-12]。同時，具有降血壓、抑制血管緊張素Ⅰ-轉換酶活性和舒張血管的功效。槲皮素和木犀草素被認為是主要的功效成分，花旗松素和α,3,2'-三羥基-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖查耳酮也被認為具有潛在降血壓作用[13]。昆侖雪菊中的類黃酮物質圣草酚-7-O-吡喃葡萄糖苷能改善脂代謝紊亂和降脂的功效，有保護線粒體功能和抑制游離脂肪酸誘導的脂肪生成的作用[14]。聚炔類物質——金雞菊苷A 和E 也被認為具有降脂作用的潛力，但還缺乏更深入的研究[15]。雪菊提取物能減弱脂多糖誘導的小膠質細胞激活，減輕神經炎癥[16]。其中，奧卡寧被確定具有抗神經炎的作用[17]。且自由基清除能力最強，在細胞中也有超強的抗氧化活性且無毒害作用[18]。在研究中發現，雪菊的石油醚提取物和乙酸乙酯提取物的抗神經炎作用最佳，其中咖啡酸甲酯、奧卡寧、槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷等被認為是主要的活性成分[19]研究表明，昆侖雪菊的總黃酮提取物能保護心肌缺血再灌注損傷、抗衰老、延緩動物腦及臟器萎縮退化的功效[20-21]。除降脂、抗炎和抗氧化的功效外，昆侖雪菊還具有一些其他的功效，如抗菌、保護細胞和清除一氧化氮等。在細胞保護方面，昆侖雪菊水提物和主要成分馬里苷與黃諾瑪苷都能抑制胰腺β細胞損傷作用，作用機制可能是抑制細胞的凋亡途徑[22]。在體外實驗中，昆侖雪菊中的總皂苷和精油提取物均有清除一氧化氮、亞硝酸鹽等作用[23-24]。

一氧化氮作為生物體的一種重要活性物質越來越受到重視，其在生物體內由一氧化氮合酶（NOS）合成，目前已經發現的NOS 有三種包括：神經型一氧化氮合酶（nNOS）、誘導性一氧化氮合酶（iNOS）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）。在腦組織中，不同類型NOS表達的時間以及含量均受氧化應激、缺血缺氧、高脂與肥胖等各種因素影響，且每種因素的影響均有所差異[25-27]。海馬區主要以神經細胞為主，有研究發現，中度低氧有利于神經細胞的增殖，過度低氧則不利于神經細胞的增殖[28]?；诶鲅┚盏闹T多研究以及海馬對于缺血缺氧的敏感性，本課題以昆侖雪菊水提物干預低氧及低氧高脂條件下的大鼠，主要觀察海馬區NOS 的表達水平。在病理情況下（低氧、高脂）一氧化氮過量產生可能通過細胞毒性作用與細胞抑制作用導致組織損傷[29]。研究證明，昆侖雪菊水提物可以調節脂代謝紊亂[30]，含有的酚類具有抗氧化活性[31]，降低谷胱甘肽過氧化，清除自由基。雪菊花提取物，通過直接進入細胞膜的甘油酯后，對生物膜的超氧陰離子自由基損傷有明顯保護作用，還可提高小鼠心腦耐缺氧能力。海馬體對缺血缺氧最敏感，iNOS激活可表達升高，造成持久連續的損傷，有研究證明，iNOS在亞急性缺血缺氧過程中表達升高具有神經毒性作用，主要參與免疫病理變化。因此，從神經損傷學角度看，iNOS水平的升高對海馬細胞的神經毒性較大[32-34]。本研究測定不同干預環境影響下各組大鼠海馬區NOS不同分型表達，NO 含量，MDA 含量以及SOD 活力，實驗數據表明HH 組較H 組iNOS 明顯升高，且CA1 區神經元細胞結構破壞加重，證實高脂飲食加重低氧環境大鼠海馬組織損傷，可能由于高脂飲食上調iNOS 所致，進而誘導細胞凋亡，產生神經毒性作用。神經膠質細胞主要在修復過程中產生，故而膠質細胞增生不明顯，提示此時期處于亞急性期，SOD 的升高與MDA的降低可能與氧化應激反應有關。eNOS 主要在腦缺血缺氧的早期表達，調節腦血流量，具有保護作用[35]，與XJH 組相比，XJHH 組eNOS mRNA 升高（P＜0.05），iNOS mRNA 明顯升高。即昆侖雪菊干預未明顯降低低氧聯合高脂飲食大鼠iNOS 表達，但相對于單純低氧，低氧聯合高脂飲食受到昆侖雪菊干預的eNOS 升高方面獲益更明顯。

nNOS 主要在中樞神經系統周圍神經系統中表達，與eNOS 均為結構型一氧化氮合酶，其中腦組織的nNOS 是一種可溶性胞質酶，在缺血缺氧狀態下NOS陽性神經元可抵御某些神經毒素的毒害作用[36]。與H組相比，XJH 組eNOS mRNA 降低（P＜0.05），nNOS mRNA 升高顯著（P＜0.05），NO 明顯升高（P＜0.05）；CA1 區無細胞水腫，細胞壞死較少，病理改變較輕。有研究發現CA1 區各層均有nNOS 的表達，且在急性低壓低氧條件下可引起nNOS 表達下降，產生損害[37]，由此可知nNOS 的表達可引起NO 含量增加，對大鼠海馬區產生神經保護性作用。與HH 組相比，XJHH 組nNOS 升高，而eNOS 與iNOS 的表達無明顯變化，結合CA3 區神經元細胞胞漿輕度疏松且無空泡，病理改變較輕，分析昆侖雪菊干預改善低氧環境下高脂飲食大鼠海馬損傷的主要原因是上調nNOS 介導的保護作用。H 組和XJH 組比，HH 組與XJHH 組相比MDA 均升高，原因主要有：①由于海馬區神經系統有豐富的脂質，故脂質過氧化增強[38]；②nNOS通過調節NO的生成從而產生保護作用。分析昆侖雪菊對高脂飲食誘導低氧環境大鼠海馬損傷的保護作用與氧化應激的調節無直接關系。

綜上所述，本研究證實高脂飲食可加重低氧環境大鼠海馬組織損傷，主要與上調iNOS 表達有關；昆侖雪菊干預可明顯減輕高脂飲食誘導的低氧環境大鼠海馬損傷，主要與上調nNOS 表達介導保護作用有關。本課題在前期研究基礎上研究高脂飲食對低氧環境大鼠海馬的影響及昆侖雪菊干預效果與機制，高原居民長期處于低氧和高脂飲食環境下，故本研究可為高原人群健康防護提供基礎，但昆侖雪菊對高原人群的海馬保護作用尚需進一步研究。