蜂膠降脂方對(duì)高脂血癥模型斑馬魚的降血脂作用研究＊

李心怡，陳荷清，夏 歡，林 生，商洪才，田貴華＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 北京 100700；2. 北京奧金達(dá)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司 北京 101507）

高脂血癥（Hyperlipidemia）是常見的脂質(zhì)代謝性疾病，主要表現(xiàn)為甘油三酯（Triglyceride，TG）、膽固醇（Cholesterol，TC）、低 密 度 脂 蛋 白（Low density lipoprotein，LDL-C）及高密度脂 蛋 白（High density lipoprotein，HDL-C）的代謝異常[1-3]。2012 年流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國成人血脂異常的患病率約為40.40%[4]；另有調(diào)查表明，全國高膽固醇血癥的患病率為4.9%，高甘油三酯血癥的患病率為13.1%[5]。高脂血癥是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，其防治已成為預(yù)防和控制心腦血管事件發(fā)生的重要措施。

臨床上推薦在控制飲食及保持運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)上，使用他汀類藥物控制血脂。他汀類藥物雖能取得較好的降脂作用，但仍存在使轉(zhuǎn)氨酶升高、血糖升高、胃腸道癥狀等不良反應(yīng)[6-7]。因此，如何在降脂同時(shí)減輕不良反應(yīng)是高脂血癥研究關(guān)注的重點(diǎn)之一。中醫(yī)理論中的“膏脂”與臨床中血脂的涵義相近，其形成多與脾虛、痰濕相關(guān)，正如《王氏醫(yī)存》所言：“肥人多痰，肥人之病，皆因脾濕所致”。故中醫(yī)藥在治療高脂血癥時(shí)多從健脾化痰入手，具有療效好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)[8]。蜂膠降脂方主要由藥食同源的蜂膠、紅曲、山楂組成，其中蜂膠、紅曲、山楂均有降脂化濁的功效，且更為安全、不良反應(yīng)小。本研究擬對(duì)蜂膠降脂方的降脂功效進(jìn)行研究，并探索該組方對(duì)TG和TC的具體調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司提供。斑馬魚以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行養(yǎng)殖，飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，電導(dǎo)作用為480-510 μS/cm；pH 為6.9-7.2；硬度為53.7-71.6 mg/L CaCO3），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（浙）2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物的制備

本研究選用的蜂膠降脂方來源于本課題組研究團(tuán)隊(duì)臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，主要由蜂膠、紅曲、炒山楂、荷葉和炒杜仲共5種藥物組成，實(shí)驗(yàn)所用各生藥均為10 g，其中研究所用蜂膠由北京奧金達(dá)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，其余生藥由東直門醫(yī)院中藥房提供。實(shí)驗(yàn)前，研究人員將蜂膠原品打粉備用。用純水浸泡除蜂膠外的其余生藥，30 min后倒出純水，加入蜂膠粉末，再加純水500 mL 至煮沸并持續(xù)煎煮20 min，然后將所得藥液倒入量杯中。再次添加純水500 mL沸水煎煮15 min，倒出第二煎藥液，合并兩煎藥液并濃縮至300 mL作為母液，母液為棕色液體，置于4℃冰箱備用。

阿托伐他汀鈣（白色粉末，批號(hào)為L(zhǎng)RAA9254，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用二甲亞砜（DMSO）配制成濃度為24 mg/mL 的母液，稀釋1000倍，置于4℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)阿托伐他汀鈣溶液濃度為0.24 μg/mL。

1.1.3 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所需儀器與相關(guān)試劑包括：解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，日 本）；心 跳 血 流 分 析 系 統(tǒng)（ViewPoint Life Sciences，法國）；與顯微鏡相連的相機(jī)（VertA1）；精密電子天平（CP214，OHAUS，美國）；多功能酶標(biāo)儀（Mithras LB940，Berthold Technologies）；6 孔板（Nest Biotech，中國）；96 孔酶標(biāo)板（costar，美國）；甲基纖維素（Sigma，美國）；鳥類用蛋黃粉（批號(hào)20170626，北京開元牌）；油紅O（Oil Red O，批號(hào)SLBP5248V，Sigma）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma，法國）；甘油三酯（TG）測(cè)試盒（批號(hào)20190327，南京建成）；總膽固醇（Total Cholesterol，T-CHO）測(cè)試盒（批號(hào)20190325，南京建成）。

1.2 分組與方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

挑選受精后發(fā)育正常的斑馬魚，首先進(jìn)行藥物最大耐受濃度測(cè)定（Maximum talerated concentration，MTC）。將中藥母液按比例進(jìn)行稀釋并分為5組，各組濃度分別為1.5625 μL/mL、3.125 μL/mL、6.25 μL/mL、12.5 μL/mL 及25 μL/mL。將180 尾斑馬魚隨機(jī)分為6組，每組30 尾，其中5 組分別給予不同濃度的中藥湯藥溶液，另有1 組為正常對(duì)照組，給予養(yǎng)魚用水飼養(yǎng)。根據(jù)MTC 結(jié)果進(jìn)行蜂膠降脂方降血脂實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中將斑馬魚隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高脂血癥模型組、中藥實(shí)驗(yàn)組及阿托伐他汀鈣對(duì)照組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 MTC測(cè)定

隨機(jī)選取180 尾受精后7 天（7 days post-fertiliza?tion，7dpf）的斑馬魚置于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）處理斑馬魚30 尾，分別給予1.5625 μL/mL、3.125 μL/mL、6.25 μL/mL、12.5 μL/mL、25 μL/mL 的中藥湯藥和養(yǎng)魚用水，每孔（實(shí)驗(yàn)組）容量為3 mL。48 h 后觀察并記錄斑馬魚的表型和死亡情況。

1.2.2.2 蜂膠降脂方的降血脂作用研究

隨機(jī)選取5dpf 的斑馬魚置于燒杯中，用蛋黃粉溶解成0.1%水溶液喂飼斑馬魚，每天喂食8 小時(shí)，建立高血脂模型。模型建立后，隨機(jī)選取90尾模型斑馬魚于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）容量3 mL，處理斑馬魚30尾；分別予中藥湯藥、阿托伐他汀鈣溶液及養(yǎng)魚用水，其中中藥湯藥濃度根據(jù)MTC 結(jié)果確定，阿托伐他汀鈣溶液濃度為0.24 μg/mL。同時(shí)，設(shè)置正常對(duì)照組斑馬魚30尾，給予養(yǎng)魚用水。48 h后將斑馬魚取出用0.3%的油紅O 液進(jìn)行染色。3 h 后進(jìn)行脫色再置于解剖顯微鏡下觀察斑馬魚尾部血管油紅O 附著情況，計(jì)算血脂光密度總和（Total light density of blood lipid，S）。

1.2.2.3 蜂膠降脂方的血脂代謝機(jī)制研究

隨機(jī)選取5dpf 的斑馬魚置于燒杯中，用蛋黃粉喂飼斑馬魚建立高血脂模型。模型建立后，隨機(jī)選取120尾模型斑馬魚于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）容量3 mL，處理斑馬魚30尾。中藥湯藥組3組，分別予0.69 μL/mL（1/9 MTC）、2.08 μL/mL（1/3 MTC）和6.25 μL/mL（MTC）濃度的中藥湯藥稀釋溶液，阿托伐他汀鈣組予0.24 μg/mL濃度的稀釋溶液。另設(shè)置正常對(duì)照組和模型組各30尾，予養(yǎng)魚用水。48 h 后隨機(jī)取出部分斑馬魚加入勻漿介質(zhì)，進(jìn)行勻漿并離心，后取上清液再用TG 及TC 試劑盒測(cè)定TG 及TG 含量。另隨機(jī)選取斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下觀察其血流速度的變化。

2 觀察指標(biāo)

2.1 血脂光密度總和（S）

研究員用油紅O 對(duì)斑馬魚進(jìn)行染色。取出斑馬魚固定后，用PBS 洗脫。室溫下，用丙二醇進(jìn)行脫水。脫水后，將斑馬魚放于0.5%的油紅O 染色液中，染色過夜。過夜后，用丙二醇進(jìn)行脫色。脫色完成后，洗脫，置于甘油中保存。觀察時(shí)，將斑馬魚置于解剖顯微鏡下拍照，觀察斑馬魚尾部血管油紅O 附著情況，利用Image-Pro Plus 6.0 高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析并采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚尾部血管血脂光密度總和（S），根據(jù)光密度總和的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)中藥湯劑的降血脂作用。降血脂作用計(jì)算公式如下：

2.2 甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）

研究員在各組處理48 h 后，隨機(jī)取出部分斑馬魚加入勻漿介質(zhì)，進(jìn)行勻漿并離心，以1500 g 離心5 min后取上清液。離心管于室溫靜置15 min 后再用TG 及TC 試劑盒測(cè)定斑馬魚體內(nèi)TG 和TC 的含量，根據(jù)TG和TC 的含量結(jié)果評(píng)價(jià)蜂膠降脂方對(duì)高血脂模型斑馬魚TG和TC的影響。

2.3 血流速度

各組處理48 h后，每組隨機(jī)挑選10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下錄制斑馬魚血流視頻，分析斑馬魚血流速度，以血流速度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)蜂膠降脂方對(duì)斑馬魚血流速度的改善作用。心跳血流分析系統(tǒng)采用120 幀/秒高速攝像頭和IEEE 800 Mbits 高速攝像頭適配器，可輕松自定義靜脈/毛細(xì)管位置的用戶界面，實(shí)現(xiàn)視野范圍內(nèi)的多個(gè)粒子的跟蹤，可進(jìn)行實(shí)時(shí)視頻捕獲，進(jìn)行高速視頻分析。

3 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理連續(xù)型變量結(jié)果用mean ± SE 表示，數(shù)據(jù)處理用SPSS20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，血脂降低作用（%）用T 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表明具有顯著性差異。蜂膠降脂方對(duì)TG和TC的影響及對(duì)血流速度的作用，運(yùn)用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表明具有顯著性差異。

表1 蜂膠降脂方處理后“濃度-致死性”結(jié)果（n=30）

4 結(jié)果

4.1 最大耐受度（MTC）結(jié)果

蜂膠降脂方在濃度為1.5625-6.25 μL/mL時(shí)，毒性表型上未見明顯異常，死亡率為0%；在濃度為12.5 μL/mL 時(shí)，6.7%斑馬魚死亡（2/30）；而濃度為25 μL/mL 時(shí)，全部斑馬魚死亡（30/30）。故蜂膠降脂方對(duì)斑馬魚的最大耐受度（MTC）為6.25 μL/mL。具體結(jié)果見表1。

4.2 油紅O染色及血脂光密度總和（S）結(jié)果

油紅O 染色結(jié)果顯示，正常組斑馬魚尾部血管無明顯油紅O 附著，高脂血癥模型組斑馬魚尾部血管可見大量油紅O 染料沉積，而阿托伐他汀鈣組和蜂膠降脂方組斑馬魚尾部血管的油紅O 染料附著較模型組明顯減少。具體結(jié)果見圖1、圖2。計(jì)算各組的血脂光密度總和，模型組斑馬魚尾部血管光密度總和為10683 像素。阿托伐他汀鈣組及蜂膠降脂方組與模型組相比，血脂降低作用分別為31% 和33%（P＜0.001）。這表明蜂膠降脂方與阿托伐他汀鈣均有明顯的降血脂作用。具體結(jié)果見表2。

4.3 TG及TC含量變化

如表3所示，模型組TG 含量較正常對(duì)照組明顯增多（P＜0.01）。阿托伐他汀鈣組TG 的整體含量（0.059 mmol/gprot）與模型組（0.135 mmol/gprot）相比明顯 較低（P＜0.01）。而蜂膠 降脂 方0.69 μL/mL、2.08 μL/mL 及6.25 μL/mL 濃度組斑馬魚整體TG 含量分 別 為 0.064 mmol/gprot、0.052 mmol/gprot 和0.066 mmol/gprot，均低于模型組（P＜0.01）。故蜂膠降脂方和阿托伐他汀鈣均能降低斑馬魚TG 水平。正常對(duì)照組（0.080 mmol/gprot）與阿托伐他汀鈣組（0.157 mmol/gprot）TC 含量均低于模型組（0.258 mmol/gprot），P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蜂膠降脂方各濃度組斑馬魚整體TC 含量與模型組比較，P值均大于0.05，提示蜂膠降脂方各濃度組的TC 含量變化與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。故在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下，蜂膠降脂方降低斑馬魚整體膽固醇水平作用不明顯。

圖1 造模后斑馬魚尾部油紅O染色情況

圖2 各組處理后斑馬魚尾部血管血脂染色情況圖

4.4 血流速度變化

如表4 所示，模型組斑馬魚整體血流速度較正常組明顯減緩（P＜0.001）；阿托伐他汀鈣組的血流速度（374 μm/s）與模型組（289 μm/s）比較，其血流速度增加64%（P＜0.01），故阿托伐他汀鈣能有效改善高脂血癥斑馬魚整體血流速度。而蜂膠降脂方各濃度組處理后的血流速度及血流改善作用與模型組對(duì)比，其P值均大于0.05，提示蜂膠降脂方組斑馬魚的血流速度與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

5 討論

高脂血癥是常見的脂代謝異常疾病，其引起的血液流變學(xué)異常和血流動(dòng)力學(xué)異常是導(dǎo)致心腦血管事件發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。高脂血癥患者TG、TC 和LDL-C水平的升高，以及HDL-C水平的降低易使紅細(xì)胞膜黏度增加，膜流動(dòng)性降低，其變形能力減弱，攜氧和運(yùn)輸氧氣的能力減弱造成組織缺氧、微循環(huán)障礙。同時(shí)，TC水平的升高推動(dòng)了脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)壁沉積，加速動(dòng)脈粥樣硬化形成[9]。大量研究表明，高甘油三酯血癥易增加冠心病、腦卒中和眼底病變等血管相關(guān)性疾病風(fēng)險(xiǎn)[10-12]，對(duì)糖尿病腎病的疾病進(jìn)程也有推動(dòng)作用[13-14]。2016 年《中國成人血脂異常防治指南》指出，TG 的輕中度增高與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[5]；且一項(xiàng)研究表明，男/女患者血液中TG 每升高1 mmol/L，其心血管疾病的發(fā)生率分別增加32%和76%[15]。一項(xiàng)meta分析結(jié)果顯示，TG每升高1 mmol/L，動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)增加22%[15]。此外，TG嚴(yán)重增高還可提高急性胰腺炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]。而高膽固醇血癥也是引起心血管疾病增加的主要原因之一，可明顯提高冠心病、腦卒中的發(fā)病率[16]；降低TC水平可顯著減少冠心病的發(fā)病率及死亡風(fēng)險(xiǎn)[17]。

故治療高脂血癥是預(yù)防冠心病和腦卒中等致死、致殘性疾病的重要措施。臨床干預(yù)時(shí)，首推他汀類藥物，其能有效降低TG、TC 及LDL-C 水平，中等劑量他汀類藥物在降脂基礎(chǔ)上能顯著降低冠心病事件發(fā)生率，且不增加非心血管病風(fēng)險(xiǎn)[6]。但他汀類藥物在取得良好療效的同時(shí)，仍有少量不良反應(yīng)，如肝功能異常、肌痛、血糖異常等，將影響患者的整體療效及遠(yuǎn)期獲益。

中醫(yī)藥在治療高脂血癥時(shí)，多認(rèn)為高血脂水平屬于“痰濕”范疇，與患者平素多食肥甘厚膩、飲食不節(jié)導(dǎo)致痰濁內(nèi)生，或素體脾虛、年老體虛導(dǎo)致脾虛不能運(yùn)化，濕濁停聚，化為脂濁相關(guān)[18-19]。此外，脂質(zhì)水平升高，即膏脂運(yùn)化失司，可使氣血運(yùn)行不暢，滯而為瘀；加之久病或年老氣虛推動(dòng)無力，血行不暢而瘀血內(nèi)生，故高脂血癥在中醫(yī)主要與“痰濕”“瘀血”等病理產(chǎn)物相關(guān)。治療時(shí)以健脾和胃、化濕降濁及活血化瘀為主。

表2 各組處理后高脂血癥模型斑馬魚的降血脂分析結(jié)果（n = 10）

表3 各組處理后斑馬魚TG和TC分析結(jié)果（n = 3）

表4 處理后斑馬血流速度結(jié)果（n = 10）

本課題組通過對(duì)比阿托伐他汀鈣，研究了蜂膠降脂方對(duì)高脂血癥模型斑馬魚的降血脂作用。結(jié)果表明，蜂膠降脂方能減少其尾部血管的血脂附著，降低體內(nèi)TG 水平；但對(duì)TC 水平的調(diào)控及血流速度的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。故蜂膠降脂方能通過降低TG 水平改善高脂血癥模型斑馬魚的血脂異常情況。

蜂膠降脂方以蜂膠、紅曲、山楂等藥食同源的藥物為主，配伍荷葉、炒杜仲共同起到降脂化濁的功效。其中，蜂膠收錄于2005 版《中華人民共和國藥典》，具有補(bǔ)虛弱、化濁脂、止消渴的功能[20]。蜂膠含有的黃酮類物質(zhì)能有效降血脂、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、清除自由基等[21-22]，并且黃酮類物質(zhì)的含量越高，蜂膠的輔助降脂作用越顯著[23]。而紅曲味甘，性溫，是秈米發(fā)酵的產(chǎn)物，具有健脾消食、活血化瘀之效。有研究發(fā)現(xiàn)，紅曲中含有的洛伐他汀是膽固醇合成酶HMG-CoA 還原酶的抑制劑。紅曲中的洛伐他汀可抑制HMG-C0A 還原酶進(jìn)而減少TC 合成[24-26]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，紅曲能降低高脂血癥模型大鼠TC、TG 和LDL-C 的水平[28]；而臨床研究結(jié)果提示，紅曲能改善老年冠心病患者的血脂水平[28]。山楂可消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂，適用于嗜食肥甘厚膩導(dǎo)致的痰濕蘊(yùn)脾。同時(shí)，現(xiàn)代研究表明山楂也含有黃酮類物質(zhì)。另外，山楂內(nèi)含有的三萜類物質(zhì)可通過提高CYP7A1、LXRα、FXR 等脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平量，促進(jìn)膽汁酸合成及膽固醇排出體外[29-32]。荷葉入肝、脾、胃經(jīng)，有清暑化濕之效。藥理學(xué)研究顯示，荷葉提取物能降低小鼠血清中TC、TG 及LDL-C 的水平，且荷葉提取物能調(diào)控小鼠HMGCR、SREBP-2、LXRα 及CYP7a1 的基因表達(dá)，影響其肝臟組織中TC 的合成與分解代謝[33]。此外，研究表明，杜仲中含有黃酮、綠原酸及環(huán)烯醚萜類化合物也具有較好的降血脂作用[33-34]。

綜上所述，蜂膠降脂方中諸藥能協(xié)同起到化濁降脂之效，降低高脂血癥中TG 水平以改善高脂血癥。但本研究仍存在一定不足，需進(jìn)一步研究、探索。一方面，本研究結(jié)果顯示對(duì)TC 水平的調(diào)控作用無顯著差異，而相關(guān)研究已證實(shí)紅曲、荷葉等單味藥對(duì)TC 水平具有調(diào)節(jié)作用，故本研究擬進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探索組方中各味藥物是否存在相互作用；另一方面，由于實(shí)驗(yàn)限制，在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中未能探討蜂膠降脂方對(duì)LDL-C 及HDL-C 的調(diào)節(jié)作用，而LDL-C 及HDL-C是血脂代謝的重要指標(biāo)，故本課題組將在后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)其進(jìn)行探索、研究。

本研究所用蜂膠均由北京奧金達(dá)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，感謝其對(duì)本研究的支持與幫助。