糖尿病肛瘺LncRNA芯片分析及CNC圖搭建＊

黃 俊，李心甜，馬 樂(lè)，耿越飛，沈詠梅，曾娟妮

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007；3. 藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610000；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410005）

肛瘺是在肛腸疾病中十分常見，主要是因?yàn)楦腥尽p傷等導(dǎo)致肛管直腸與肛周皮膚相通的異常管道，其一般無(wú)法自愈，保守治療只能暫時(shí)緩解患者痛苦，但容易反復(fù)發(fā)作，而手術(shù)治療是根治肛瘺的主要方式之一。但是因?yàn)槠浒l(fā)病部位比較特殊，術(shù)后創(chuàng)面容易污染，傷口感染概率較大，若加之合并糖尿病，則會(huì)增加創(chuàng)面感染概率，延長(zhǎng)愈合時(shí)間，甚至遷延不愈，形成慢性難愈合創(chuàng)面。因此，積極促進(jìn)肛瘺創(chuàng)面的愈合是我們研究的重點(diǎn)。LncRNA（longnon-codingRNA）是長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，不被翻譯為蛋白質(zhì)，早前被認(rèn)定為是基因組轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物[1,2]。隨著近年來(lái)，對(duì)于LncRNA研究越來(lái)越多，其功能也被逐漸發(fā)現(xiàn)。目前研究認(rèn)為，LncRNA 在生命過(guò)程中扮演著重要角色，對(duì)多種生理及病理過(guò)程都有調(diào)節(jié)作用，LncRNA 表達(dá)的異常，是多種疾病（如糖尿病、癌癥等）的發(fā)生、發(fā)展的重要原因[3-6]，近幾年也有研究提出其亦參與創(chuàng)面愈合的調(diào)控。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)LncRNA 認(rèn)識(shí)的逐步加深，本項(xiàng)目旨在對(duì)糖尿病肛瘺創(chuàng)面差異表達(dá)LncRNA 基因芯片表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，建立LncRNA 與mRNA 之間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并研究關(guān)鍵LncRNA 的作用機(jī)制，從而探討慢性難愈合創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)促愈藥物提供基礎(chǔ)研究。

圖1 差異LncRNA 及mRNA 的箱體圖、散點(diǎn)圖

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)組樣本選自3例收治于湖南省中醫(yī)院肛腸科的復(fù)雜性肛瘺合并2 型糖尿病患者，對(duì)照組樣本來(lái)源于湖南省中醫(yī)院肛腸科收治的3 例復(fù)雜性肛瘺患者，術(shù)中均用雙氧水、生理鹽水清洗傷口后，絡(luò)合碘消毒，待創(chuàng)面新鮮肉芽長(zhǎng)出，用組織剪剪除創(chuàng)面中央直徑約0.5 cm肉芽，立即放入標(biāo)本管并放于干冰中凍存，隨后立即將標(biāo)本交于上海康成生物工程有限公司代為保管；標(biāo)本記錄本上仔細(xì)登記患者信息；待標(biāo)本收集完后由上海康成生物工程有限公司應(yīng)用Arraystar 人類LncRNAV4.0版芯片完成長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜的檢測(cè)。本研究獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并將其目的及風(fēng)險(xiǎn)告知受試者，由受試者簽署同意書。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.2.1 肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家中醫(yī)藥管理局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肛腸分會(huì)肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，復(fù)雜性肛瘺：管道有2條以上，位于肛管直腸環(huán)以上，且有2個(gè)以上外口或內(nèi)口。

1.1.2.2 2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2017年版）》制定[8]：臨床癥狀：典型的“三多一少”癥狀，即多食、多飲、多尿和體重下降；2、實(shí)驗(yàn)室檢查：空腹血糖＞7.0 mmol/L 或餐后兩小時(shí)血糖＞11.1 mmol/L。無(wú)上述癥狀的患者需再次檢查。

圖2 差異mRNAs 的KEGG 通路圖

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述復(fù)雜性肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合上述2型糖尿病的;③簽訂知情同意書并配合觀察的患者。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①低位肛瘺或1 型糖尿病患者；②合并有其他肛腸疾病者；③合并其他慢性腸道疾病，如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎患者；④孕婦及哺乳期婦女；⑤近期用抗凝藥物或搭有心臟支架患者。

1.2 微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)lncRNA

1.2.1 總RNA提取和質(zhì)量控制

標(biāo)記RNA 前使用Agilent ND-1000檢測(cè)RNA 是否降解并檢測(cè)RNA濃度。

1.2.2 標(biāo)記和雜交

Arraystar RNA Flash Labeling Kit 對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，芯片雜交實(shí)驗(yàn)使用Agilent SureHyb進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集和標(biāo)準(zhǔn)化

芯片經(jīng)過(guò)洗滌后，應(yīng)用Agilent DNA Microarray Scanner 掃描。使用Agilent Feature Extraction 軟件（v11.0.1.1)獲得采集芯片探針信號(hào)值。使用軟件Agilent GeneSpring GXv12.1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4 差異表達(dá)分析和功能分析

挑選差異表達(dá)LncRNA 和差異表達(dá)mRNA 的軟件為Agilent GeneSpring GXv12.1 軟件。篩選標(biāo)準(zhǔn)為2 倍差異及P ＜0.05，再進(jìn)行差異表達(dá)分析，然后對(duì)差異表達(dá)的mRNAs 進(jìn)行KEGG 通路分析及Pathway Map 展示，挑選出顯著mRNA 指標(biāo)，將這些顯著mRNA 指標(biāo)進(jìn)行q-PCR 驗(yàn)證，得到有意義的陽(yáng)性指標(biāo)，將這些陽(yáng)性指標(biāo)與差異LncRNA 交集得出LncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并基于LncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)挑選出不同LncRNA進(jìn)行功能驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 將芯片標(biāo)準(zhǔn)化后，篩選基準(zhǔn)為2 倍差異及P ＜0.05 進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)二組有19871 個(gè)無(wú)差異lncRNA，上調(diào)差異有502 個(gè)，下調(diào)差異有1204 個(gè)；mRNAs 分析發(fā)現(xiàn)二組有16485 個(gè)無(wú)差異，上調(diào)差異621 個(gè)，下調(diào)差異505 個(gè)。其具體箱體圖及散點(diǎn)圖見圖1。

圖1 為長(zhǎng)鏈非編碼RNA 及mRNA 的箱體圖、散點(diǎn)圖。箱體圖顯示檢測(cè)之后的LncRNA（A）及mRNA（B）在分布情況上趨于一致。（C）圖紅色為在糖尿病肛瘺術(shù)后創(chuàng)面表達(dá)上調(diào)2 倍的LncRNA，綠色為下調(diào)2 倍的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（P ＜0.05）。（D）紅色部分為在糖尿病肛瘺術(shù)后創(chuàng)面中表達(dá)上調(diào)2 倍的mRNA，綠色部分為下調(diào)2倍的mRNA。

2.2 對(duì)差異表達(dá)的mRNAs 進(jìn)行KEGG 通路分析（見圖2）

圖2 為差異表達(dá)的mRNAs 的KEGG 通路分析：A為在糖尿病肛瘺術(shù)后創(chuàng)面中下調(diào)的10條通路分別是：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction-Homo sapiens）、阿 米 巴 病（Amoebiasis-Homo sapiens）、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路（Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells-Homo sapiens）、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensin system-Homo sapiens）、JAK STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑（Jak-STAT signaling pathway-Homo sapiens）、癌 癥 的 途 徑（Pathways in cancer-Homo sapiens）、TGF-β 信號(hào)通路（TGF-beta signaling pathway-Homo sapiens）、哮喘（Asthma-Homo sapiens）、AGERAGE 信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications-Homo sapiens）、炎癥性腸病(IBD）（Inflammatory bowel disease（IBD）-Homo sapiens），其中下調(diào)最明顯的是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction-Homo sapiens）；B 為在糖尿病肛瘺術(shù)后創(chuàng)面中上調(diào)的前10 條通路，分別是：破骨細(xì)胞分化（Osteoclast differentiation-Homo sapiens（human））、利什曼病（Leishmaniasis-Homo sapiens（human））、肺結(jié)核（Tuberculosis-Homo sapiens (human)）、金葡菌感染（Staphylococcus aureus infection-Homo sapiens（human））、吞 噬 體（Phagosome-Homo sapiens（human））、抗原處理及呈遞（Antigen processing and presentation-Homo sapiens（human））、自然殺傷細(xì)胞細(xì)胞毒活性（Natural killer cell mediated cytotoxicity-Homo sapiens（human））、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis-Homo sapiens（human））、移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease-Homo sapiens（human））、炎癥性腸病（IBD）（Inflammatory bowel disease（IBD）-Homo sapiens（human））、同種異體移植排斥反應(yīng)（Allograft rejection-Homo sapiens（human）），上調(diào)最明顯的是破骨細(xì)胞分化（Osteoclastdifferentiation）通路。

圖4 內(nèi)參校正圖

2.3 基于上述KEGG通路分析的Pathway Map展示

基于上述KEGG 通路分析，下調(diào)最明顯的Cytokine-cytokinereceptorinteraction，上調(diào)最明顯的是Osteoclast differentiation 通路，分別將其進(jìn)行Pathway Map展示（見圖3）。

A 為糖尿病肛瘺術(shù)后創(chuàng)面中下調(diào)最明顯的Cytokine-cytokinereceptorinteraction-Pathway 展示圖，黃色代表有影響意義指標(biāo)，有：CCL26、IL6、LIF、IL13、CSF2、IL5、HGF、IFNB1、IL2&RA、SF21、SF19、BMP2；B為糖尿病肛瘺術(shù)后創(chuàng)面中上調(diào)最明顯的Osteoclast differentiation-Pathway 展示圖，橙色代表有影響意義指標(biāo)，有：IFNy、c-Fms、IFNGR、Ig-like R FcRy、Ig-like R DAP12、STAT1、PI3K、MKK6、NADPH、STAT1/2、AP1、CTSK、c-Fos。

2.4 對(duì)8個(gè)最有影響意義的指標(biāo)行q-PCR驗(yàn)證

基于上述對(duì)mRNA 的KEGG 通路分析及Pathway Map 展示，從中挑選8 個(gè)指標(biāo)（BMP2、IFNB1、IL6、IL18、PIK3CB、SMAD7、SMAD9、β-actin）進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證，以β-actin 作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，從而得到內(nèi)參校正圖（圖4）。

從上圖4 可以了解到，BMP2、IL6、IL18、PIK3CB、SMAD7 的P 值小于0.05，說(shuō)明這5 個(gè)基因有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再結(jié)合芯片標(biāo)準(zhǔn)化后結(jié)果，這5個(gè)基因與基因標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果趨勢(shì)一致，表示這5 個(gè)基因?yàn)殛?yáng)性，說(shuō)明這5 個(gè)基因指標(biāo)有意義。

2.5 LncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

將Q-PCR 驗(yàn)證得到的5 個(gè)有意義的mRNA 指標(biāo)與相應(yīng)的LncRNA 進(jìn)行關(guān)系分析，從而得到LncRNAmRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。

圖5 LncRNA與mRNA基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

紅色標(biāo)記為L(zhǎng)ncRNA；藍(lán)色標(biāo)記為mRNA。正相關(guān)為實(shí)線，負(fù)相關(guān)為虛線。

2.6 基于LncRNA-mRNA的CNC圖分析

IL6 和IL18 在促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)方面具有重要作用。IL6 是一種細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，并能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能，所以IL6 涉及多種炎癥相關(guān)疾病，包括糖尿病和系統(tǒng)性幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；而IL18 屬白介素-1 家族，是一種前炎癥細(xì)胞因子，可促進(jìn)釋放炎性細(xì)胞因子，并調(diào)節(jié)其相互之間的作用關(guān)系，所以對(duì)于機(jī)體內(nèi)炎性反應(yīng)具有強(qiáng)大調(diào)節(jié)的作用[9]。結(jié)合LncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，選取20 個(gè)LncRNA 指標(biāo):NR_125383、T323486、 ENST00000582334、 TCONS_00018312、ENST00000418393、 TCONS_00017190、 TCONS_00019532、 ENST00000601559、 ENST00000566575、NR_109882、 NR_026913、 T301537、 NR_109774、ENST00000415536、 ENST00000610000、ENST00000412485、 ENST00000573220、 T175957、ENST00000580756、TCONS_00014747（選取 標(biāo)準(zhǔn) 為PCC 絕對(duì)值值較大且長(zhǎng)度不超過(guò)2000），其中:NR_125383、 T323486、 ENST00000582334、 TCONS_00018312、 ENST00000418393、 TCONS_00017190、TCONS_00019532、 ENST00000601559、ENST00000566575、NR_109882 和IL6 有明顯相關(guān)性，NR_026913、 T301537、 NR_109774、ENST00000415536、 ENST00000610000、ENST00000412485、 ENST00000573220、 T175957、ENST00000580756、TCONS_00014747 和IL18 具 有 明顯相關(guān)性，說(shuō)明此20 個(gè)LncRNA 或正或負(fù)影響著IL6或IL18，從而影響著創(chuàng)面的修復(fù)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)該20個(gè)LncRNA 此前在不同領(lǐng)域中均有不同程度的報(bào)道，如ENST00000418393 通過(guò)調(diào)控HTERT 來(lái)調(diào)控胃癌細(xì)胞[10]、ENST00000580756 與血管畸形導(dǎo)致中風(fēng)有關(guān)[11]，ENST00000566575 與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、胸主動(dòng)脈瘤、鼻咽癌、青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸等有關(guān)[12-15]，NR_026913 與小細(xì)胞癌有關(guān)[16]，但在創(chuàng)面愈合及炎癥反應(yīng)中的報(bào)道相對(duì)較少，說(shuō)明這些相關(guān)LncRNA 仍有許多功能暫未得知，需要我們進(jìn)一步探討，為后續(xù)的功能和機(jī)制研究提供了方向和重點(diǎn)，為加速慢性難愈合創(chuàng)面愈合的研究提供了新的思路，為開發(fā)促愈藥物提供基礎(chǔ)研究。

3 討論

最初，LncRNA 被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪聲”，不具備任何生物學(xué)功能，但越來(lái)越多的LncRNA 被識(shí)別并發(fā)現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄的生物功能中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，吸引了大量的關(guān)注，隨之也成為研究熱點(diǎn)，至今，已有超過(guò)12000 的LncRNAs 被收錄在人類基因組中。近年來(lái)，對(duì)于LncRNA 的研究越來(lái)越多，其中對(duì)于炎癥性疾病的研究比比皆是，比如洪宏海[17]等人發(fā)現(xiàn)，LncRNA-MT1JP 受到干擾后，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞MH7A 的炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-8 表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)MT1JP 可以調(diào)控p53 蛋白水平，表明MT1JP 可能通過(guò)調(diào)控p53 蛋白水平從而調(diào)控炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8在關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。周彩蘭[18]等人發(fā)現(xiàn)LncRNANONHSAG057461.1 在被PM2.5 干擾后，可以抑制炎癥因子IL-1β 的表達(dá)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)當(dāng)用NFκB阻斷劑BAY11-7082 后，LncRNA-NONHSAG057461.1的 轉(zhuǎn) 錄 水 平 明 顯 降 低 ，說(shuō) 明 LncRNANONHSAG057461.1 本 身 可 能 受TLR2/MyD88/NFκB通路的調(diào)控。同時(shí)lncRNA 還在人類多種疾病當(dāng)中都具有調(diào)控作用，如克羅恩病，前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等[19-22]。

本研究應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)觀察lncRNA 與mRNAs 在人體樣本的糖尿病肛瘺創(chuàng)面及普通肛瘺創(chuàng)面的表達(dá)譜，篩選基準(zhǔn)為2倍差異及P ＜0.05進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)差異有502 個(gè)，下調(diào)差異有1204個(gè)；mRNAs 分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)差異621 個(gè)，下調(diào)差異505個(gè)。對(duì)差異表達(dá)的mRNAs 進(jìn)行KEGG 通路分析及其上調(diào)、下調(diào)最明顯的通路的Pathway Map 展示，篩選出8 個(gè)最有影響力的指標(biāo)，行q-PCR 驗(yàn)證，得到5 個(gè)陽(yáng)性基因指標(biāo)，將5個(gè)陽(yáng)性基因指標(biāo)結(jié)合相關(guān)前期LncRNA再搭建LncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)已搭建的LncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，從中選取PCC 絕對(duì)值值較大且長(zhǎng)度不超過(guò)2000 的LncRNA 共20 個(gè)，該20個(gè)LncRNA 此前在不同領(lǐng)域中均有不同程度的報(bào)道，為后續(xù)的功能和機(jī)制研究提供了方向和重點(diǎn)，為加速慢性難愈合創(chuàng)面愈合的研究提供了新的思路，為開發(fā)促愈藥物提供基礎(chǔ)研究。

綜上，本研究在國(guó)內(nèi)率先應(yīng)用基因芯片技術(shù)搭建LncRNA 與mRNA 的CNC 基因網(wǎng)絡(luò)圖，從分子生物學(xué)角度，并結(jié)合現(xiàn)代芯片技術(shù)，了解糖尿病肛瘺的發(fā)病機(jī)制，為全面探討LncRNA 在創(chuàng)面修復(fù)中的作用機(jī)制等方面提供新思路，加之近年來(lái)對(duì)LncRNA 的研究越來(lái)越深入，這將對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面的治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，同時(shí)為開發(fā)促愈藥物提供方法支持和思路借鑒。