垂黃清脈沖劑干預治療冠心病穩(wěn)定型心絞痛熱毒痰瘀證患者NF-κB信號通路的研究＊

趙 凱，葉曉輝

（1. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 銀川 750004； 2. 西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院 西安 710010）

冠心病（coronary atherosclerotic heart disease,CAD）是動脈粥樣硬化導致機體器官病變中最常見的一種類型，主要是由脂質代謝障礙形成動脈粥樣硬化斑塊導致冠狀動脈管腔狹窄或閉塞不通使心肌發(fā)生缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病。穩(wěn)定型心絞痛是最常見、最具代表性的心絞痛類型，指由心肌缺血缺氧引起前胸陣發(fā)性的壓榨性窒息樣感覺，主要位于胸骨后，可放射至心前區(qū)和左上肢尺側面、右臂和兩臂的橈側面或頸部與下頜部，持續(xù)數(shù)分鐘，往往在休息或舌下含服硝酸甘油后癥狀迅速消失。其臨床表現(xiàn)在1-3 個月內相對穩(wěn)定，發(fā)作頻率、疼痛程度、持續(xù)時間以及緩解方式等相對比較固定，斑塊也不易破裂。以男性多見，40歲以上人群多發(fā)。病因主要為冠狀動脈粥樣硬化引起，還可由主動脈瓣狹窄或關閉不全、梅毒性主動脈炎、肥厚性心肌病等，勞力、情緒激動、飽餐、受寒等是常見誘因。近年來，人類的膳食結構和生活方式隨著社會和經濟的不斷發(fā)展而發(fā)生著巨大改變。致使冠心病的發(fā)病率和死亡率正在全球范圍內迅速増加上升，且發(fā)病人群越來越趨于低齡化[1]。2017 年全球疾病負擔國際合作研究報告[2]表明，冠心病患病人數(shù)估計值為1.1 億，仍處于不斷上升趨勢，是目前全球第一大“死亡殺手”。每年因冠心病死亡人數(shù)約為892萬。2018年中國疾病預防控制中心研究報告[3]數(shù)據(jù)顯示，從1990 年到2013 年，由冠心病導致死亡在總死亡中所占比例由8.6%增加至15.2%，在所有心血管疾病死亡中所占比例由29%增加至37%。該研究根據(jù)1990 年冠心病死亡人數(shù)估算出2013 年中國冠心病死亡總人數(shù)為139.4萬，較1990年增加了90%。多項研究結果也顯示，我國冠心病的發(fā)病和死亡人數(shù)將隨著人口老齡化進程的加劇而不斷增加。

中醫(yī)學中無“冠狀動脈”一詞的記載，古醫(yī)籍中也未出現(xiàn)對冠狀動脈粥樣硬化的論述，故中醫(yī)學中并無冠心病病名。中醫(yī)文獻中根據(jù)解剖部位、疼痛性質及程度、持續(xù)時間等綜合后將冠心病歸屬于“胸痹心痛”范疇[4]。張仲景《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》中總結病機為“陽微陰弦”，即心氣、心陽虛弱為本虛，寒凝、氣滯、血瘀、痰飲等病理因素為標實。隨著經濟的高速發(fā)展，現(xiàn)代人生活方式也發(fā)生著巨大改變。喜食肉類肥甘厚味，嗜食辛辣炙煿之品等這些不良飲食習慣，損傷脾胃，痰濁內生，郁而化火；“五志過極皆為熱病”情志內傷亦可化火；心理壓力大，生活節(jié)奏快，嗜煙飲酒成癮，吸煙與高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、年齡、遺傳并稱為導致冠心病發(fā)生的六大獨立危險因素；冠心病患者大多高齡陰血虧耗，長期服用香竄溫燥藥物或濫用保健品，尤其是人參類溫補過度，更宜陰虛火旺，灼傷陰血，化生毒熱；現(xiàn)代人體質偏陰虛陽熱者越來越多，肥胖、血壓高、血脂高、血糖高、血黏高、負荷高、免疫力低，體內脂、糖、痰、濁、瘀毒蘊結蓄積不出。此外環(huán)境污染中的廢水、廢氣、工業(yè)垃圾、全球氣溫變暖、復雜耐藥的病原微生物感染等，更易致火熱之邪侵入體內，蘊結日久化成熱毒，傷津劫液，灼傷營血，損傷心絡，痹阻心脈而發(fā)病。

隨著冠心病熱毒痰瘀病機學說與動脈粥樣硬化炎癥反應研究的不斷深入，部分學者總結出動脈粥樣硬化和冠心病中的炎癥反應機制可歸屬于中醫(yī)“毒邪學說”中的內毒和外毒范疇[5]；血脂高、血黏高、尿酸高等狀態(tài)和氧自由基、內皮功能損傷以及脂代謝紊亂可歸結為痰瘀膠結互阻久郁化熱，損傷脈絡所致，綜合形成了熱毒痰瘀證的病機。有研究表明[6]動脈粥樣硬化的形成中血管內皮損傷，脂質沉積的過程相當于痰濁證，內皮細胞損傷，血小板聚集，血液高凝狀態(tài)相當于血瘀證。脂質浸潤、炎癥損傷反應以及血小板聚集等學說與中醫(yī)痰、瘀互結理論相符[7]。本研究通過我院經臨床診斷收治的94 例冠心病穩(wěn)定型心絞痛熱毒痰瘀證患者為研究對象，探討垂黃清脈沖劑干預治療冠心病穩(wěn)定型心絞痛熱毒痰瘀證患者的臨床療效及對NF-κB信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本試驗選取2017 年12 月-2019 年1 月就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院心內科和中醫(yī)科門診及住院部臨床確診為冠心病穩(wěn)定型心絞痛，中醫(yī)辨證為熱毒痰瘀證型的患者為受試者，并隨機分為對照組和試驗組，共納入98 例，脫落4 例，最終納入94 例。其中男性50例，女性44 例，男性占總病例數(shù)的53.19%，女性占總病例數(shù)的46.81%，對照組男性25 例，女性23 例，年齡40-80 歲，平均年齡65.44 ± 11.65 歲；試驗組男性25例、女性21 例，年齡43-80 歲，平均年齡62.53 ± 10.00歲。94 例患者中合并高血壓人數(shù)者最多，其次是2 型糖尿病、高脂血癥、腦梗死。對兩組患者的性別、年齡、合并癥分布分別經χ2檢驗和獨立樣本t 檢驗，差異均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入、排除及診斷標準

西醫(yī)診斷標準參照《內科學》第8 版，人民衛(wèi)生出版社，“冠心病—穩(wěn)定型心絞痛”診斷標準[8]。中醫(yī)診斷標準參照《中醫(yī)內科學》第2 版，人民衛(wèi)生出版社，“胸痹心痛”診斷標準和《中藥新藥臨床研究指導原則》2002年版，中國醫(yī)藥科技出版社，相關診斷標準[9]。中醫(yī)辨證標準參考王瓊[10]、李景君[11]等對胸痹心痛—熱毒痰瘀證型擬定的主癥和次癥診斷標準。納入標準、排除標準、病例剔除和脫落標準、中止試驗標準等詳見本課題前期已發(fā)表的臨床療效觀察研究方案[12]。

1.3 治療方案

本試驗采用中西醫(yī)結合治療方案。在受試前和受試期間，兩組患者均給予低鹽低膽固醇飲食，對有合并癥者均給予對癥治療。常規(guī)西藥治療藥物：阿托伐他汀鈣片20 mg，每晚一次，口服（批準文號：國藥準字H20093819，規(guī)格：20 mg×7 片，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司）。阿司匹林腸溶片100 mg，每日1 次，口服（批準文號：國藥準字H20153035，規(guī)格：100 mg × 45片，石藥集團）。將服用常規(guī)西藥+銀丹心腦通軟膠囊設為對照組，銀丹心腦通軟膠囊主要成分：銀杏葉、丹參、燈盞細辛、絞股藍、山楂、大蒜、三七、艾片。用法用量：口服，一次2-4 粒，一日3 次。（批準文號：國藥準字Z20027144，規(guī)格：0.4 g × 12 粒× 3 板，貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司制造）。服用常規(guī)西藥+垂黃清脈沖劑設為試驗組，垂黃清脈沖劑藥物組成：垂盆草（生產批號：1801002C）、大黃（生產批號：1804001W）、昆布（生產批號：1802001H）、牡蠣（生產批號：1809001W）、蒲黃（生產批號：1804001S）、茯苓（生產批號：1805001C）等。免煎配方顆粒劑單味小包裝藥物采用單味中藥有效成分提取物煎煮、濃縮制備，由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供。服法：熱水200-300 ml沖服，每日1劑，早晚分服。所有受試者均連續(xù)服藥，1個療程時長為4周，共3個療程。

1.4 觀察指標與檢測方法

多層螺旋CT 對冠狀動脈狹窄程度的診斷具有較高的準確性。根據(jù)美國心臟病協(xié)會所規(guī)定的冠狀動脈血管圖像記分分段評價標準，評定每支冠狀血管病變狹窄程度采用Gensini 評分法[13]，因此對所有受試者治療前后行冠狀動脈CT 檢查，并將Gensini 積分作為療效觀察指標之一。由至少2位中級以上職稱醫(yī)師行冠狀動脈CT 檢查操作，共同評估患者病變部位、性質、狹窄程度，并出具檢查報告單，由試驗研究人員當場計算Gensini評分。

血清樣本收集：所有受試者均在入院次日和療程滿后次日清晨各取空腹肘靜脈血3 ml。使用EDTA 檸檬酸鹽抗凝管進行收集，并離心處理。轉速3000 r·min-1，時間：10 min；分離血清后凍存于-80℃冰箱中待測。

血清炎性因子測定：采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（Elisa 法）檢測兩組受試者用藥前后血清中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核轉錄因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）、白 介 素-6（Interleukin-6，IL-6）、血 管 細 胞 粘 附 分 子-1（VCHDcular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、細胞間 粘 附 分 子-1（Intercellular adhesion molecule-1，VCAM-1）、白介素-1（Endothelin-1，ET-1）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）的濃度水平。

1.5 療效判定標準

臨床療效的判定參照2002年衛(wèi)生部頒布的《中藥新藥臨床研究指導原則》[14]。總有效率=（顯效+ 有效）/總例數(shù)（n）×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計方法采用SPSS22.0 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計分析過程中試驗知曉人員不得參與，以免數(shù)據(jù)產生人為偏倚。計量資料以xˉ±S進行統(tǒng)計描述，符合正態(tài)分布及方差齊性采用t檢驗，組間均數(shù)比較采用獨立樣本t 檢驗，治療前后比較采用配對樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布時采用非參數(shù)檢驗或秩和檢驗。檢驗水準α=0.05，以P ＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，以P＜0.01認為有統(tǒng)計學顯著性差異。

表1 Gensini積分對比（Xˉ± S）

表2 臨床療效比較（n，%）

1.7 倫理學審查

本試驗研究已通過寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學科研倫理審查委員會的批準。

2 研究結果

2.1 冠狀動脈狹窄程度比較

將兩組患者冠狀動脈狹窄程度的Gensini 積分進行對比。與本組治療前比較，兩組患者治療后冠狀動脈狹窄程度均明顯改善（P＜0.05，P＜0.01）。與對照組比較，試驗組冠狀動脈狹窄程度明顯降低（P＜0.05），詳見表1。

2.2 臨床療效比較

試驗組患者的總有效率明顯高于對照組（P＜0.05），詳見表2。

2.3 兩組患者治療前實驗室指標濃度比較

將兩組患者治療前實驗室指標進行對比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表3。

2.4 炎性因子濃度水平比較

對兩組患者每組治療前、后血清中TNF-α、NFκB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 濃度水平均進行配對樣本t檢驗，均有統(tǒng)計學顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。與治療前比較，兩組患者治療后血清中TNF-α、NFκB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 濃度水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與對照組比較，試驗組患者治療后降低更顯著（P＜0.01）。

表3 治療前實驗室指標濃度比較（Xˉ± S）

對兩組患者治療后血清中炎性因子TNF-α、NFκB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 濃度水平進行獨立樣本t檢驗。與對照組比較，試驗組TNF-α、NF-κB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1濃度水平降低更明顯（P＜0.05），詳見表4中各組t值。

2.5 血管內皮功能評價指標比較

對兩組患者每組治療前、后血清中NO、ET-1濃度水平均進行配對樣本t檢驗，均有統(tǒng)計學顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。與治療前比較，兩組患者治療后血清中NO 濃度水平均明顯升高，ET-1 濃度水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與對照組比較，試驗組患者治療后NO 濃度水平升高、ET-1 濃度水平降低趨勢更為顯著（P＜0.01）。

對兩組患者治療后血清中內皮功能評價指標NO、ET-1 濃度水平進行獨立樣本t檢驗，與對照組比較，試驗組NO 濃度水平升高、ET-1 濃度水平降低更明顯（P＜0.05），詳見表5中各組t值。

2.6 安全性評價

94 例患者在為期3 個療程的治療過程中，治療前后患者的各項安全指標（血常規(guī)、尿常規(guī)、糞便常規(guī)+隱血試驗、肝腎功能等檢查）均未見與治療藥物相關的明顯異常差異。

表5 治療前后血管內皮功能評價指標水平對比（Xˉ± S）

3 討論

3.1 垂黃清脈沖劑對NF-κB信號通路的影響

動脈粥樣硬化的形成機制涉及到多種細胞及細胞因子、粘附分子、生長因子等多個因素[15-16]。其中NF-κB 信號通路對AS 發(fā)生和發(fā)展的影響是多方面的，不僅參與了炎癥反應，還對血管內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖遷移、氧化應激進行調控、誘導血管細胞凋亡等，是調控轉錄多種因子的中心環(huán)節(jié)和共同通路。

當血管內皮細胞受損引發(fā)炎癥反應時，促使多種炎性細胞聚集并遷移至損傷部位。他們被激活后導致TNF-α的生成與釋放增加。TNF-α作為NF-κB 信號通路的上游元件及早期啟動因子引發(fā)炎癥反應，并維續(xù)炎癥擴大和級聯(lián)，加速AS 的發(fā)生發(fā)展[17]。TNF-α大量釋放后誘導NF-κB 信號通路的下游元件中白介素（主要為IL-1 和IL-6）的生成和ICAM-1、VCAM-1過度表達，并刺激多種細胞產生炎癥因子和趨化因子。其中IL-6在NF-κB信號通路中扮演著多種角色，可通過對肝臟肝細胞的刺激來生成C 反應蛋白（Creactionprotein，CRP）等急性反應蛋白，被作為炎癥反應的一個標志物來反映炎癥的程度。由VCAM-1 和ICAM-1 介導的單核細胞與血管內皮細胞間黏附是冠心病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，也是出現(xiàn)在動脈粥樣硬化形成過程中最早的現(xiàn)象之一[18]。這些因子基因的啟動子和增強子與NF-κB 中對應的一個或多個κB 序列相結合，從而使NF-κB被激活。激活后的NF-κB又是這些因子的活化劑，使IL-6、TNF-α、VCAM-1 和ICAM-1基因被活化，增強其轉錄功能，使這些因子的產生和釋放增多。而NF-κB 在激活這些炎性因子的同時，它們又成了NF-κB 通路的激活劑，刺激NF-κB 過表達，以惡性循環(huán)的方式加劇炎癥反應，甚至出現(xiàn)炎癥反應失控。只有當NF-κB 被激活并導致這些炎癥相關因子過度表達，才會引起明顯的炎癥反應[19]。在這一過程中炎性因子IL-6、TNF-α、VCAM-1 和ICAM-1 和釋放出來的相關細胞因子形成正負反饋環(huán)激活NF-κB,引起細胞因子不斷上調和炎癥持續(xù)，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[20-21]。Collins 和Cybulsky 在研究中發(fā)現(xiàn)[22]，NF-κB 表達的區(qū)域很可能最終衍化為動脈粥樣硬化斑塊，而缺乏NF-κB 表達的部位形成粥樣斑塊可能性則較小。

表4 治療前后炎性因子水平對比（Xˉ± S）

本課題從“邪毒”理論出發(fā)，結合現(xiàn)代對冠心病發(fā)病機制的研究，探討中藥新配方垂黃清脈沖劑對冠心病治療作用機制。以前期已經完成的冠狀動脈粥樣硬化模型動物實驗及體外實驗[23-24]表明中藥新配方垂黃清脈沖劑及其拆方可上調I-κBmRNA 的表達和下調NF-κBmRNA 的表達而發(fā)揮抗主動脈粥樣硬化閉塞癥的作用；含藥血清可對體外因TNF-α高表達引起的血管內皮損傷起到一定程度的保護作用，減輕TNF-α對內皮細胞器的破壞，且高濃度含藥血清對內皮細胞的保護作用更明顯，推測其作用靶點可能與抑制TNF-α的表達有關。本課題前期已經完成對垂黃清脈沖劑的臨床療效觀察試驗，結果表明垂黃清脈沖劑可使冠心病穩(wěn)定型心絞痛熱毒痰瘀證患者的血脂水平顯著降低，使血清同型半胱氨酸濃度下降，同時抑制了脂質代謝和炎癥反應的表達；明顯縮小患者動脈粥樣硬化斑塊，降低冠狀動脈狹窄程度；改善了患者臨床癥狀。

本次試驗結果顯示，治療前兩組患者的血清中TNF-α、NF-κB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 濃度水平均出現(xiàn)高表達，治療后濃度水平則呈現(xiàn)顯著降低趨勢，其中試驗組降低程度尤為明顯。因此，可以推測垂黃清脈沖劑能有效抑制血管內皮細胞進入活化狀態(tài)，抑制血管內皮與炎癥細胞間、多種炎癥細胞間以及炎癥細胞與細胞外基質間的粘附作用，從而降低炎癥和免疫反應，減緩動脈粥樣硬化的發(fā)生，其機制可能與垂黃清脈沖劑能夠作用于NF-κB 信號通路，下調血清中NF-κB 信號通路上游元件TNF-α的表達水平，減少其對NF-κB的激活，同時下調NF-κB信號通路下游元件IL-6、ICAM-1、VCAM-1的表達水平，阻止炎癥反應發(fā)生級聯(lián)效應有關。

3.2 垂黃清脈沖劑對血管內皮功能的影響

在冠心病發(fā)病過程中，血管內皮功能發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[25]血管內皮功能受損可能是心血管病變發(fā)生的開始和核心環(huán)節(jié)。內皮損傷會導致動脈彈性降低，引發(fā)粥樣硬化改變。對血管內皮功能的評估是預測冠心病患者未來心血管事件發(fā)生的一項獨立指標，血管的舒張收縮依賴于血管內皮結構的完整性，因此可以把ET-1/NO 比值作為內皮功能的一項重要評價指標。

近年來研究發(fā)現(xiàn)血管舒張因子NO 和血管收縮因子ET-1 的動態(tài)平衡變化在調節(jié)血管壁收縮，維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起到了重要的作用[26]。生理狀態(tài)下，內皮細胞同時釋放NO 舒張血管，ET-1 收縮血管，兩者協(xié)調平衡，共同維持著血管內皮功能。病理狀態(tài)下，NO合成和釋放減少，ET-1生成增加，兩個指標的比例平衡被打破，血管順應性降低，加速了內皮功能的損傷，促進了動脈粥樣硬化的形成。Velasco 等[27]認為動脈粥樣硬化時，ET-1的增高和NO分泌減少，使得ET-1/NO 比值的動態(tài)平衡失調，這種失調也可能是導致ET-1 分泌增多的原因之一，而ET-1 分泌過多使得血管收縮過度，又加重了內皮功能的損傷。

本研究結果顯示，治療前兩組患者的血清ET-1水平均出現(xiàn)高表達，NO 水平均出現(xiàn)低表達，且ET-1升高、NO 降低水平與冠狀動脈管腔狹窄程度密切相關。治療后兩組患者血清ET-1 水平均顯著降低，NO水平則均升高，尤以垂黃清脈沖劑組ET-1 水平降低、NO 水平升高趨勢更明顯。因此，可以推測垂黃清脈沖劑能有效抑制血管平滑肌細胞收縮和增殖，擴張血管，保護血管內皮功能，其機制可能與下調血清中ET-1 表達水平、上 調NO 水平，減小ET-1/NO 比值有關。

由于時間及條件的限制，本課題采用了單盲、隨機、對照臨床觀察的研究方法，目前還無法做到對患者未來病情發(fā)展情況進行追蹤。希望在后續(xù)的研究中可以更好的做到雙盲或雙盲雙模擬以及對患者遠期病情進行追蹤觀察。