參附益心方對缺氧條件下大鼠原代心肌細胞線粒體DNA相關基因表達的影響＊

馬 騰，李 彬，王新陸，謝世陽，高 原，朱明軍，王永霞

（1. 河南中醫藥大學 鄭州 450000；2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院 鄭州 450000）

心力衰竭（簡稱“心衰”）是各種臨床心臟疾病發展到晚期階段的一種表現，其發生、發展過程復雜，死亡率居高不下[1]。心衰時，心肌細胞處于能量代謝失衡狀態，可導致心肌收縮功能不全和心室重構的進展。線粒體是能量代謝的樞紐，是細胞中的“發電站”，也是脂肪、糖和氨基酸氧化和釋放能量的最后場所。而線粒體DNA(mtDNA)的表達，是電子傳遞鏈、氧化磷酸化和ATP 合成的重要組成部分，對心肌細胞能量代謝具有重要意義。

參附益心方源自于河南中醫藥大學，是孫建芝教授治療慢性心衰的臨床經驗方，具有益氣、溫陽、活血、利水等功效。當下認為，中醫中的“氣”與現代醫學的“能量”、“ATP”具有相同的物質基礎[4]，從氣血理論方面可對參附益心方改善心衰患者心功能、改善預后進行闡述。前期臨床研究發現參附益心方能改善心衰患者癥狀、心功能、提高生活質量及改善預后[5]。另外，本課題組經過前期相關基礎研究[6-9]，發現參附益心方可能通過調控相關miRNA、信號通路發揮改善心肌細胞能量代謝的作用，從而發揮改善心功能、抗心衰、延緩或逆轉心肌重構的作用。本試驗在缺氧誘導的原代心肌細胞損傷模型中，通過觀察參附益心方對缺氧誘導的心肌細胞ATP 和LDH 含量，ND-1、ND-2、COX、tfam基因的表達，進一步驗證參附益心方對心肌細胞線粒體DNA基因表達的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級1-3 d 新生SD 乳大鼠，購自河南省實驗動物中心，雌雄不限，生產許可證號：SCXK（豫）2015-0005。

1.2 儀器設備

TDL-50B 型低速臺式大容量離心機（北京醫用離心機廠）；MK3型酶標儀（德國Thermo Scientific 公司）；JA203 型電子分析天平（上海海康電子儀器廠）；IKAV-MAG HST 型磁力攪拌器（中國蘇州艾卡公司）；BCM-1000A型生物超凈工作臺（江蘇蘇凈集團安泰公司）；DMI 3006倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；CK 40倒置顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）；Rco-3000tvbb 二氧化碳培養箱（Revco，美國）；Inucyte zom 長時間細胞動態成像分析系統（Sensi技術有限公司）；ABI 7300型熒光定量PCR儀（美國AB公司）。

1.3 實驗試劑

Dulbecco's Modified EagleMedium（DMEM）培養基（Solarbio公司）；0.08%心肌細胞消化液（Trypsin 0.16 g；NaCl 1.6 g；NaHCO30.070 6 g）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries 公司）；磷酸鹽平衡液PBS（NaCl 8.00 g；KCl 0.20 g；Na2HPO41.56 g；KH2PO40.24 g；ddH2O 1 000 mL）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；葡萄糖0.198 2 g；KCl 0.059 6 g；HEPES 0.4 g；ddH2O 200 mL）；YOYO-1染料（美國Invitrogen公司）4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國西格瑪公司）；溴脫氧尿核苷（Brdu，美國Sigma 公司）；心肌肌鈣蛋白I（cTnI）抗體（武漢博士德公司）；Strept Actividin-Biotin Complex（SABC-FITC，小鼠IgG）（武漢博士德公司）；腺苷三磷酸（ATP）檢測試劑盒（瑞士羅氏公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成）；逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen 公司）；擴增試劑盒（美國Invitrogen 公司）；0.4%臺盼藍（華美生物工程公司）；Opti-MEM 培養基（美國Gibco 公司）；輔酶（能氣朗）Q10 片（Coenzyme Q10）（衛材(中國)藥業有限公司，10 mg/片）；參附益心方（SF，山東步長制藥有限公司），1 g 浸膏≈9.5 g 生藥，參附益心方浸膏得率10.5%。

2 方法

2.1 藥液制備（現用現配）

2.1.1 參附益心方藥液制備

參考相關文獻[8]，電子分析天平稱取SF 浸膏干粉0.25 g，添加DMEM 培養液10 ml，吹打混勻，過濾器（0.22 μm）用于過濾和去除細菌，制成參附益心方母液（25 mg/ml）。

2.1.2 輔酶Q10藥液制備

取輔酶Q10 片5 片，研磨壓碎，加入5.8 ml DMEM培養基，用過濾器（0.22 μm）過濾，制成輔酶Q10 母液（1×10-2mol/L）。

2.2 原代心肌細胞的分離

取1-3 d 的SD 乳鼠，無菌條件下開胸取乳鼠心臟，棄去心房與心耳部位，獲得心室部分，預冷PBS 緩沖液沖洗干凈后將其剪成組織塊（大小約1-2 mm3）。添加心肌細胞消化液后移至玻璃瓶中，放入37℃水浴鍋中，振蕩水浴6 min，多次消化，直到組織塊變為白色透明（約7-8次），第一次消化后，自然沉淀，去上清，之后自然沉淀后留取上清。向上清液中加入相同量含10%FBS+DMEM 培養液后輕輕吹打制成細胞懸液，離心（1000 r/min）10 min。棄去上清，加入適量10%FBS+DMEM 培養基，吹打混勻，200 目篩網過濾，獲得細胞懸液。

2.3 原代心肌細胞的培養

取“2.2”細胞懸液，種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%的CO2培養箱，差速貼壁法1.5 h，抽出上清液，1000 r/min 離心5 min 后，棄上清得到心肌細胞，加入含10%FBS + DMEM 培養液吹打混勻，臺盼藍染色計算細胞數目，調整細胞濃度為4×105個/mL，接種于培養板，加入BrdU（0.1 mmol/L）抑制成纖維細胞的增殖。培養48 h，棄去上清液，加入DMEM 培養液，無血清同步化24 h。

2.4 原代心肌細胞的鑒定

培養3 d 后，棄培養液，加入4%多聚甲醛固定（10～20 min），滴加cTnI 多克隆抗體（兔多克隆抗體1∶50），4℃冰箱中孵育過夜。SABC-FITC 標記二抗（羊抗兔1∶100）避光孵育2 h 后，DAPI 染料避光5 min，水溶性封片劑封孔，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。取拍照視野6 個，鏡下計數細胞總數為（N1），計數熒光陽性細胞數作為心肌細胞數(n1)，根據公式：心肌細胞比例=n1/N1×100%。

2.5 CCK-8篩選藥物最合適濃度

將心肌細胞接種在96孔細胞板上，培養48 h后，無血清同步化24 h，分為Normal組、SF（參附益心方）組（濃度分別為0.1 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、0.75 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml）、Coenzyme Q10 組（濃度分別為1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L），培養24 h 后，更換新鮮培養基，并且每孔加入CCK-8 試劑10 ul，CO2培養箱中避光孵育2 h，酶標儀檢測OD值（λ=450 nm）。

2.6 建立缺氧模型

提取的原代心肌細胞在常氧條件下放置48 h，無血清同步化24 h，各缺氧組中加入YoYo-1 染料2 ul，通過惰性氣體法制造心肌細胞缺氧模型，液氮罐供氣，使得溫箱氣體成分調整為90%N2、5%O2、5%CO2，經過長時間細胞動態成像分析系統分析后，檢測每組活細胞個數，最終確定最合適的缺氧時間為6 h。正常組氧含量正常。

2.7 實驗分組及干預方法

確定各組最合適濃度及缺氧時間后，取“2.3”中培養成的原代心肌細胞，每孔中加入含10%FBS +DMEM 培養液2 mL，然后對細胞進行分組，即Model組、Normal 組、Coenzyme Q10 組（1 × 10-4mol/L）、SFL組（0.25 mg/mL）、SFH 組（0.5 mg/mL）五組，置于5%O2、5%CO2、90%N2條件下培養6 h，進行缺氧損傷（正常組除外）。

2.8 試劑盒檢測原代心肌細胞ATP含量

采用熒光素酶發光法，通過酶標儀檢測心肌細胞中ATP 的含量，前期處理方案及分組同“2.7”，給藥和造模后，將上清液吸出丟棄，用PBS 在室溫下洗滌2-3次，每次1 分鐘，嚴格按照三磷酸腺苷（ATP）檢測試劑盒的規定操作。

2.9 試劑盒檢測原代心肌細胞乳酸脫氫酶（LDH）含量

具體步驟如下：2 μmol/mL 丙酮酸標準品用雙蒸水稀釋制作標準曲線，樣品孔中分別加入20 μl 樣血清，25 μl底物緩沖液(含0.3 M 乳酸），對照孔以蒸餾水替代血清，37℃孵育15 min，然后加入25 μl的2,4二硝基苯肼溶液（1 mM），37℃孵育15 min，然后加入氫氧化鈉溶液（0.4 M），混勻，室溫孵育5 min，酶標儀上測定OD 值（λ=420 nm）。代入標準曲線擬合公式，計算乳酸脫氫酶含量。

2.10 RT-PCR 檢測線粒體ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表達

前期處理方案及分組同“2.7”，缺氧條件培養6 h，RNA 提取 試劑盒 提取RNA，1 ug 總RNA 逆轉 錄 為cDNA，GAPDH 為內參，20 ul 體系擴增線粒體ND-1、ND-2、COX、tfam 基因，反應條件為：首先進行90 s 的95℃預變性后進行PCR 循環，然后進行10 s 的95℃變性，30 s 的60℃退火，共循環40 次。擴增結束后，緩慢加熱升溫，從65℃至95℃，建立關于PCR 的產物溶解曲線。2-ΔΔCT法計算各組基因的相對含量，具體各引物序列如下：ND-1 序列：上游引物：CTACATACAACTACGCAAAGGC，下游引物：GCTTAGAGCTAGTGTAAGGGAG，擴增 長 度166；ND-2 序 列：上 游引 物：TACCCGAAGTCACCCAAGGA，下游引物：GGCGCCAACAAAGACTGATG，擴增長度155；COX 序列：上游引物GTCTTGTTTGCTTTCTTTGC，下游引物：GGTACTGTCGTTCCAGACTATC，擴增長度：142；tfam 序列：上游引物：GTCAGCCTTATCTGTATTCCGA，下游引物：ACTTTTGCATCTGGGTGTTTAG，擴增長度131；GAPDH序列：上游引物：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游引物：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT，擴增長度252 bp。2.11 用SPSS19.0 軟件對所有實驗結果進行統計分析，實驗數據以xˉ±s表示，P＜0.05 提示數據的變化趨勢有差異性，P＜0.01 提示有顯著差異性。組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 原代心肌細胞的鑒定

此次實驗以山羊抗大鼠cTnI 作為一抗、采用免疫熒光法檢測鑒定原代心肌細胞的純度。使用差速貼壁法1.5 h 后，繼續培養48 h，鏡下觀察原代心肌細胞呈星形或者梭形交織聚集生長，融合成單細胞層，局部致密區形成細胞簇，可見同步化搏動。cTnI 一抗熒光染料細胞胞質染色均勻，純度達標（85%），符合細胞實驗要求，具體數據參照前期本團隊發表文章[9]。

3.2 參附益心方對原代心肌細胞活性的影響

結果顯示，0.1、0.25、0.5 mg/mLSF 組細胞活性與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；0.75、1.0、1.5 mg/mLSF 組可使細胞活性明顯下降，與對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）證明此濃度范圍對心肌細胞產生毒副作用?；诖藵舛让鳎筮x擇SF濃度為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL進行后續實驗。

表1 缺氧條件下參附益心方對原代心肌細胞LDH含量的影響(± s)

表1 缺氧條件下參附益心方對原代心肌細胞LDH含量的影響(± s)

組別正常組模型組輔酶Q10組LDH，mU/ml 93.10±2.79 418.75±30.18 109.51±15.37組別參附益心方低劑量組參附益心方高劑量組LDH，mU/ml 167.66±18.41 116.87±9.12

圖1 缺氧條件下參附益心方對原代心肌細胞LDH含量的影響

3.3 Coenzyme 10對原代心肌細胞活性的影響

結果顯示，1×10-3mol/L Coenzyme 10組細胞活性與對照組相比，細胞活性增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L Coenzyme 10 組細胞活性與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；基于此濃度摸索，選擇Coenzyme 10 濃度1 ×10-4mol/L組進行后續實驗。

3.4 缺氧條件下參附益心方對原代心肌細胞ATP 含量的影響

前期結果表明，缺氧條件下原代心肌細胞ATP 含量與正常組相比明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與Model 相比，SFH 組、輔酶Q10 均可提高缺氧條件下原代心肌細胞ATP含量（P＜0.01）。具體數據參照前期本團隊發表文章[10]。

3.5 缺氧條件下參附益心方對原代心肌細胞乳酸脫氫酶（LDH）含量的影響

結果表明，缺氧條件下原代心肌細胞LDH 含量與Normal 組相比明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；參附益心方、輔酶Q10 均可降低缺氧條件下原代心肌細胞LDH含量，與Model組相比，差異具有統計學意義（P＜0.01），見表1、圖1。

3.6 缺氧條件下參附益心方對mtDNA 相關基因表達的影響

缺氧條件下，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表達與其他各組相比明顯降低，與Normal 組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。SFH組、輔酶Q10組ND-1基因表達可見明顯升高，與Model組相比，具有統計學意義（P＜0.05）；SFH 組、SFL 組、輔酶Q10 組ND-2 基因表達可見明顯升高，與Model組相比，具有統計學意義（P＜0.05）；SFH組、SFL組、輔酶Q10組COX基因表達可見明顯升高，與Model組相比，具有統計學意義（P＜0.05）；SFH 組、SFL 組、輔酶Q10 組tfam 基因表達與Model組相比，無統計學意義（P＞0.05）。

4 討論

線粒體是細胞的能量工廠，在能量生產過程中發揮著重要作用。人類線粒體DNA 包含16569 對堿基，編碼基因37 個，其中有13 種編碼呼吸鏈復合體和ATP 合成酶，包含NADH 脫氫酶亞基1（ND-1）、NADH脫氫酶亞基2（ND-2）、環氧化酶（cycloxygenase，COX）等，它們是氧化磷酸化、電子傳遞鏈和ATP 合成的重要部分，其基因的突變或者表達的下降，都會影響呼吸鏈復合體I 酶活性降低，細胞內ATP 合成減少[11-13]。COX 基因對于線粒體呼吸鏈而言非常重要，是其重要組成部分之一，對ATP 的產生和功能意義重大[14]，ND-1、ND-2 不僅是線粒體DNA 的編碼基因，也是NADH脫氫酶的一個亞單位，而NADH 是線粒體呼吸鏈的起始酶和標志物，線粒體內ATP 大多數是經過NADH 的電子傳遞產生[15]，故線粒體DNA 相關因子ND-1、ND-2、COX 基因在ATP 合成、能量代謝中的作用至關重要，其表達水平可以反映出線粒體能量代謝的水平[16]，研究其表達對研究心衰治療藥物的作用靶點亦具有重要的意義。此外，線粒體轉錄因子A（tfam）是一種核基因編碼的DNA 結合蛋白。tfam 基因不僅有助于維持線粒體DNA的結構，改善線粒體損傷[17-19]，同時也參與氧化磷酸化及ATP 的合成，研究發現，tfam 對mtDNA 的轉錄、數量、功能維持起關鍵作用[20]，其表達水平的提高，能促進線粒體的合成和數量，從而促進ATP 的合成[21]。綜上所述，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因的表達水平的改變可以反映出SF 對線粒體能量代謝的影響。乳酸脫氫酶是參與糖酵解和糖異生的重要酶，心力衰竭時心肌細胞處于缺氧狀態，LDH 代償性增加，通過糖無氧酵解以代償性產生ATP 維持心肌細胞能量[22]。

圖2 缺氧條件下參附益心方對原代心肌細胞ND-1、ND-2、COX、tfam基因表達的影響

祖國醫學沒有“心衰”病名，但其臨床癥狀似屬中醫典籍水腫、喘癥、心悸、胸痹范疇，且對此早有描述，如《金匱要略》：“心水者，其身重而少氣，不得臥，煩而燥，其人陰腫”明確的說明其病理因素為“水”。另外，已有前期實驗證實西方醫學中“ATP”“能量”與祖國醫學之“氣”具有相似的理論與物質基礎[4]，心衰患者ATP 合成減少，心肌細胞能量匱乏，從而造成心臟儲備力耗竭，中醫典籍《傷寒明理論》言：“其心氣虛者，由陽氣內弱，心下空虛，正氣內動而為悸也”對心衰的癥狀做了描述，且指出其“心氣虛”，與ATP 合成減少、能量匱乏不謀而合。參附益心方是河南名醫孫建芝教授的臨床經驗方，配伍精良，選方得當，其具體成分為人參、附子、桂枝、丹參、赤芍、益母草、豬苓、澤瀉、葶藶子、砂仁、大棗，經前期研究此方辯證立足于心氣虛[23]，方中君藥為人參，具有補益心氣的功效，從西方醫學來說，人參能改善心肌細胞的能量代謝，增加ATP 含量。參附益心方總括于陰陽，參之以“水”“淤”等病理因素，以活血化瘀、益氣溫陽、利水消腫為治法，對于心衰患者效如桴鼓。

經過前期臨床研究和實驗研究發現，心衰時心肌收縮力降低，心臟輸出量減少，缺血缺氧的病理狀態使得心衰癥狀加重，而參附益心方可以增加心肌收縮力、增加ATP 合成，以保護心肌細胞，減輕心力衰竭癥狀[5-7]。本次實驗目的在于探究缺氧條件下參附益心方對心肌細胞線粒體DNA 基因的表達作用。實驗結果顯示：與Normal 組對比，Model 組ATP 合成減少，LDH 合成增加，ND-1、ND-2、COX、tfam 基因表達下降，說明缺氧條件下，原代心肌細胞線粒體內相關基因表達下降，ATP 合成減少，能量代謝障礙；與Model組對比，SF 組可提高大鼠心肌細胞ATP 含量，降低LDH 含量，增加ND-1、ND-2、COX 基因的表達，因此參附益心方可能通過作用于心肌細胞線粒體的基因表達，來提高ATP的合成，降低LDH 合成，以保護心肌細胞，穩定線粒體膜電位，對緩解心衰患者臨床癥狀與維持心肌細胞能量代謝意義重大。