不同螯合劑對香石竹(Dianthus caryophyllus)修復鎘污染土壤的影響

馬俊俊,吳 炯,祖艷群,陳建軍

(云南農業大學 資源與環境學院/云南農業大學 學生處,云南 昆明 650000)

現代農業技術的快速發展以及含重金屬的化肥、農藥等的大量使用,導致土壤重金屬污染日益嚴重,這不僅使土壤肥力、農產品產量和品質下降,而且重金屬元素通過在農作物中的富集而影響農產品食品安全,從而間接危害人體健康。據統計,我國鎘污染農田面積超過了1.3萬hm2,涉及11個省市的25個地區,并且部分地區的鎘污染已相當嚴重[1]。

近年來,植物修復技術由于其環境友好、投資和維護成本低、操作簡便等優點,日益受到人們的重視和青睞，并成為學術界研究的熱點課題。根據作用過程和機理,重金屬污染土壤的植物修復技術可分為植物提取、植物揮發和植物穩定；植物提取不僅能夠有效降低土壤中的重金屬含量,而且被認為是最經濟有效的植物修復手段[2]。大部分重金屬在土壤中的生物活性較低,能夠被植物直接利用的部分很少,這大大限制了植物的修復效率。螯合劑具有廣泛的配位性能,幾乎能與所有的金屬離子形成穩定的螯合物,可以改變重金屬在土壤中的形態分布,從而使重金屬由不溶態轉化為可溶態,大大活化土壤中的重金屬,增加重金屬離子的溶解度,為植物吸收土壤中的重金屬創造有利條件,并顯著增強重金屬向植物地上部分的轉運[3]。在土壤重金屬污染修復應用及研究中采用的螯合劑主要有2大類型：第一類是氨基多羧酸類(amino poly carboxylic acids, APCAs),如人工合成的螯合劑EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二乙三胺五三乙酸)、HEDTA(羥乙基替乙二胺三乙酸)、EGTA(乙二醇雙四乙酸)、EDDHA(乙二胺二乙酸)、CDTA(環已烷二胺四乙酸),以及天然螯合劑S,S-EDDS(S,S-乙二胺二琥珀酸)和NTA(二乙基三乙酸)等，其中APCAs因具有較強的活化能力而被廣泛應用,尤其是EDTA；還有一類是一些天然的低分子有機酸(Natural low molecular weight organic acids, NLMWOAs),如檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、丙二酸等,能促進金屬離子的解吸附作用,通過與金屬離子形成可溶性的絡合物來增加金屬離子的活性和移動性[4]。人工合成的APCAs類螯合劑容易對植物產生毒害作用,其本身及其形成的金屬絡合物難以被微生物降解,長期存在于土壤中造成二次污染,而且會與土壤中植物必需的營養元素Ca、Mg、Fe等形成絡合物,造成營養元素的潛在流失[5]。生物源螯合劑EDDS、LMWOAs以及其金屬絡合物在土壤中容易被微生物降解,其引發的潛在生態環境風險要遠遠小于人工合成的螯合劑。有關研究發現螯合劑誘導強化植物修復的效果受諸多因素的影響,如螯合劑種類、施入濃度和劑量、施入時間、施入方式、植物種類、土壤理化性質等[6]。因此,選擇最合適的螯合劑種類及其添加濃度對于提高植物提取效果具有重要意義。

香石竹是石竹科石竹屬的多年生草本植物,其生物量大,易繁殖,易養護,花期長,顏色豐富,觀賞價值較高,不僅具有土壤修復潛力，還可以美化環境,帶來經濟效益；此外，香石竹作為觀賞性花卉不進入食物鏈,可用于替代種植,有利于鎘污染土壤的安全利用。但現在有關香石竹對土壤鎘的吸收累積特征研究較少。鑒于此，筆者以香石竹為材料,通過模擬盆栽試驗,比較了在Cd污染土壤脅迫下施加螯合劑EDTA、CA及OA對香石竹吸收、轉運及富集土壤重金屬Cd的影響,旨在為螯合劑誘導植物修復技術在實際Cd污染土壤利用和修復中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為五彩香石竹(Dianthuscaryophyllus),其種苗采購于云南省昆明市繽紛花卉有限公司。供試螯合劑為分析純EDTA、OA及CA。供試土壤取自云南農業大學后山表層0～20 cm的紅壤,其基本理化性質如下: pH值為5.78,有機質質量分數為78.32 g/kg,全氮、全磷、全鉀的質量分數分別為2.59、0.31、82.13 g/kg,堿解氮、有效磷、速效鉀的質量分數分別為18.41、9.56、81.03 mg/kg。

1.2 試驗方法

采用模擬盆栽試驗,將供試土壤自然風干,剔除雜草、碎石,在壓碎并混勻后,過2 mm篩,裝入塑料盆(規格26 cm×26 cm)中,每盆土壤3.5 kg。外源施加到土壤中的鎘質量比為10 mg/kg干土(Cd以CdCl2·2.5H2O為外源形式,均勻施加于土壤中),并一次性施入基肥；將處理土壤充分攪拌均勻后,保持含水量為田間持水量的60%～70%,靜置平衡4周。在平衡結束后,選取生長較好且長勢一致的香石竹幼苗，將其移栽到鎘污染土壤的盆中,每盆1株。將所有盆栽香石竹置于云南農業大學后山溫室大棚中,定期澆水調節盆中土壤的含水量，使之約為田間持水量的60%。

在香石竹栽培120 d后,按試驗設計分別向土壤中加入相應的螯合劑。在施加前,將螯合劑按一定濃度比例配成溶液,并且調節pH值至6.5左右,然后澆灌加入植物根部周圍土壤。EDTA、OA和CA均設置4個濃度梯度,即2.5、5.0、7.5及10.0 mmol/kg土,以添加等量的水溶液作為空白對照(CK),每個處理設3個重復。螯合劑分3次施加,每盆每次施加量是33 mL(第3次是34 mL),施加時間間隔為3 d,總計施加100 mL。在施加螯合劑后,定期灌溉土壤,在最后一次處理7 d后收獲香石竹,進行各項指標的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 香石竹生物量的測定 將香石竹從盆中連根移出,先用自來水洗凈泥土,再用去離子水沖洗3次。分根、莖、葉、花裝入紙袋,放入烘箱中于105 ℃殺青30 min,然后于75 ℃烘干至恒重，最后稱取干重(g)。

1.3.2 香石竹鎘富集量的測定 先將香石竹按根、莖、葉、花分別粉碎、混勻，然后分別稱取粉末0.50、1.00、1.00、1.50 g,加入至聚四氟乙烯消解罐內罐，再加硝酸4 mL浸泡過夜,再加過氧化氫(30%)2 mL,蓋好內蓋,旋緊不銹鋼外套,放入恒溫干燥箱,在120～140 ℃下保持3～4 h,在箱內自然冷卻至室溫,最后將消化好的樣品用去離子水定容至25 mL。溶液中的Cd濃度采用火焰原子吸收分光光度法進行測定。

1.3.3 土壤中有效態鎘含量的測定 采集香石竹根際土壤并風干,過2 mm篩，備用。稱取5.000 g土樣于100 mL具塞錐形瓶中,加入25.00 mL CaCl2提取劑,在室溫(25 ℃±2 ℃)下放入水平式往復振蕩器中，振蕩2 h后離心,將最初的5～6 mL濾液棄去,對剩下的濾液采用火焰原子吸收分光光度法測定鎘含量。

1.3.4 富集系數、轉移系數及富集量的計算 香石竹各器官Cd累積量=Cd含量×相應器官的干重(g)。香石竹根-莖、莖-葉、葉-花轉移Cd的能力用轉移系數(TF)表示：TF根-莖=莖Cd含量/根Cd含量；TF莖-葉=葉Cd含量/莖Cd含量；TF葉-花=花Cd含量/葉Cd含量。植物對Cd的富集能力用富集系數(BAF)表示: BAF某器官=某器官Cd含量/根際土壤Cd含量。

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel 2010對重復樣的平均值與標準差進行計算，應用SPSS 23.0對數據進行差異顯著性比較,采用OriginPro 9.0作圖分析。

2 結果與分析

2.1 螯合劑對香石竹生長的影響

如圖1所示,在鎘脅迫下不同螯合劑對香石竹的生物量均產生了一定的影響,同種螯合劑不同處理濃度對香石竹地上部、地下部及單株干重的影響也不相同。總體上,在螯合劑EDTA、OA處理下,香石竹植株的干重隨著濃度的增高先增大后減小。在CA處理下, CA 5 mmol/kg時植株干重最低,所有處理與對照無顯著性差異。引起這一現象的原因可能是低濃度的螯合劑緩和了重金屬對植物的毒害作用；而隨著螯合劑濃度的增加,螯合劑本身對植株生長產生了一定的抑制作用。

如圖1a所示,在螯合劑EDTA處理下,當EDTA 5.0 mmol/kg時,地上部干重最大,顯著高出對照4.5 g； EDTA 10 mmol/kg處理與對照的地上部干重相比降低了0.27 g；其它處理的地上部干重與對照無顯著差異。在螯合劑CA處理下, CA 10.0 mmol/kg時地上部干重顯著高出對照3.56 g；在其它處理下與對照無顯著性差異。OA在2.5 mmol/kg時地上部干重顯著高出對照3.97 g；在其它處理濃度下與對照無顯著性差異。在低濃度(2.5 mmol/kg)時,不同螯合劑處理下的地上部干重之間無顯著性差異。EDTA 5.0 mmol/kg處理與OA 5.0 mmol/kg處理間植株地上部干重無顯著性差異,并顯著高于CA 5.0 mmol/kg處理下的植株地上部干重。EDTA 7.5 mmol/kg、CA 7.5 mmol/kg和OA 7.5 mmol/kg處理間地上部干重無顯著性差異。CA 10.0 mmol/kg處理下的地上部干重顯著高出EDTA 10.0 mmol/kg處理下的,但與OA 2.5 mmol/kg處理下的無顯著性差異。

如圖1b所示,螯合劑EDTA、CA、OA處理下的地下部干重均與對照無顯著性差異。低濃度(2.5 mmol/kg)EDTA、CA、OA處理間的地下部干重無顯著性差異。OA 5.0 mmol/kg處理下的地下部干重顯著高出CA 5.0 mmol/kg處理下的。在7.5 mmol/kg和10.0 mmol/kg下，不同螯合劑處理間的地下部干重無顯著性差異。

如圖1c所示,在螯合劑EDTA處理下,單株干重隨著螯合劑濃度的增加先升高再降低,其中以EDTA 5.0 mmol/kg處理下的單株干重最高,顯著高出對照和EDTA 10.0 mmol/kg處理下的。在螯合劑CA處理下, CA 10.0 mmol/kg時單株干重最高,是對照的1.36倍；其它處理組與對照無顯著差異。在螯合劑OA處理下, OA 2.5 mmol/kg和OA 5.0 mmol/kg時,單株干重顯著高于對照, OA 7.5 mmol/kg和OA 10.0 mmol/kg處理下的單株干重略低于OA 5.0 mmol/kg處理下的。

2.2 不同螯合劑對香石竹鎘含量的影響

如圖2所示,在螯合劑EDTA處理下,隨著濃度的增加,香石竹根、莖、葉、花中的鎘含量先增大后減小。其中根部中的鎘含量均顯著高于對照, EDTA 7.5 mmol/kg時根部鎘含量最高,比對照提高了51%； EDTA 2.5、5.0、7.5 mmol/kg時莖中的鎘含量分別較對照顯著提高了76%、80%、42%； EDTA 10.0 mmol/kg時莖中的鎘含量與對照無顯著性差異。EDTA處理組葉中的鎘含量均顯著高于對照,且在EDTA 5.0 mmol/kg處理下鎘含量最高，比對照提高了82%； EDTA在2.5、5.0、7.5 mmol/kg時花中鎘含量分別比對照顯著提高了71%、63%、67%； EDTA 10.0 mmol/kg時花中鎘含量與對照無顯著性差異。隨著EDTA濃度的增大,香石竹植株鎘含量先增大后減小,均顯著高于對照, EDTA 5.0 mmol/kg時單株鎘含量最高,比對照顯著高出72%。說明在試驗濃度范圍內, EDTA輔助香石竹吸收土壤鎘的效果較好,其中EDTA濃度低于10.0 mmol/kg有助于香石竹植株各個部位對鎘的吸收,EDTA 10.0 mmol/kg對香石竹莖和花吸收土壤鎘的影響不明顯。在EDTA 5.0 mmol/kg處理下香石竹對土壤鎘的吸收效果最好。

圖1 不同螯合劑處理對香石竹生物量的影響

在螯合劑CA處理下, CA 5.0 mmol/kg時根部鎘含量顯著比對照提高了43%；在其它處理下根部鎘含量與對照無顯著性差異。CA處理組的莖部和花中鎘含量與對照無顯著性差異。CA 2.5、7.5、10.0 mmol/kg時葉中鎘含量分別比對照顯著提高了51%、38%、43%； CA 5.0 mmol/kg時葉中鎘含量與對照無顯著差異。CA處理組單株的鎘含量與對照無顯著差異(圖2)。

在螯合劑OA處理下,只有在5.0 mmol/kg和7.5 mmol/kg下根中鎘含量與對照存在顯著性差異,分別比對照高出48%、38%；而在OA處理下莖中鎘含量與對照組不存在顯著性差異。OA處理下葉中鎘含量均顯著高于對照,其中OA 7.5 mmol/kg時葉中鎘含量最大,比對照組提高了68%。在OA 2.5 mmol/kg處理下花中鎘含量顯著高于對照55%；在其它濃度OA處理下花中鎘含量與對照無顯著性差異。OA處理組單株鎘含量均顯著高于對照組,且OA 7.5 mmol/kg時最高,比對照高42%(圖2)。綜上所述, 在OA 7.5 mmol/kg處理下香石竹對鎘的吸收效果最好,且OA是天然有機小分子有機酸,施入土壤后,不會對環境造成二次污染。

2.3 不同螯合劑對香石竹富集轉運鎘的影響

表1和表2為鎘污染土壤中不同螯合劑及濃度處理下,香石竹的轉運系數與富集系數。由表1可知,3種螯合劑不同處理中,對于TF根-莖來說, EDTA 2.5 mmol/kg和5.0 mmol/kg時顯著高于對照,分別比對照提高了62%、64%； CA 5.0 mmol/kg時顯著低于對照，但CA其它濃度下與對照無顯著性差異； OA處理下與對照無顯著性差異,說明低濃度的EDTA(≤5.0 mmol/kg)有助于鎘從香石竹根部到莖部的轉移。就TF莖-葉而言, EDTA 2.5 mmol/kg和5.0 mmol/kg時與對照無顯著性差異,在EDTA其它濃度處理下均顯著高于對照,說明螯合劑EDTA在7.5和10.0 mmol/kg時有助于鎘在香石竹植株內由莖到葉的轉移；在CA和OA設置濃度下TF莖-葉均顯著高于對照。關于TF葉-花, 在EDTA和CA設置濃度下均低于對照,在OA 2.5和5.0 mmol/kg處理下高于對照,說明低濃度OA(≤5 mmol/kg)有助于鎘在香石竹植株內由葉到花的轉移。

由表2可知,3種螯合劑不同處理均對香石竹植株對鎘的富集系數產生了影響。其中, EDTA在所有濃度處理下均顯著提高了根部、葉部和整株的富集系數； EDTA 2.5、5.0、7.5 mmol/kg顯著提高了莖部和花對鎘的富集系數,說明EDTA有利于香石竹對鎘的富集,但高濃度(10.0 mmol/kg)EDTA不利于香石竹莖部和花部對鎘的富集。CA 5.0 mmol/kg顯著提高了根部對鎘的富集系數,但在CA其它濃度處理下與對照無顯著性差異。對于莖部、花和整株,CA設置濃度下的富集系數與CK無顯著性差異。CA 2.5、7.5和10.0 mmol/kg顯著提高了葉部對鎘的富集系數。OA 7.5和10.0 mmol/kg顯著提高了香石竹根部對鎘的富集系數,OA設置濃度下莖部對鎘的富集系數與CK無顯著性差異,葉部對鎘的富集系數較CK顯著提高了100%～300%, OA 2.5 mmol/kg下花對鎘的富集系數較CK顯著提高了100%；在OA其它處理濃度下與CK無顯著性差異；在 OA處理下,整株對鎘的富集系數較CK顯著提高了50%。

因此，低濃度EDTA(≤5 mmol/kg)不僅有利于香石竹對鎘的富集，而且有助于鎘由地下部向地上部的轉移。CA對香石竹對鎘的轉運系數和富集系數影響不太明顯。OA對香石竹對鎘的富集系數和由地下部向地上部的轉運系數的影響較CA明顯。

圖2 不同螯合劑處理對香石竹植株鎘含量的影響

表1 螯合劑對香石竹植株鎘轉運系數的影響

2.4 螯合劑對香石竹鎘累積量的影響

由圖3可見,隨著EDTA濃度的升高,香石竹根部的鎘累積量先增加后減小,在EDTA 7.5 mmol/kg時鎘累積量達到最大(2.62 μg),較CK增加了79%。在CA處理下,香石竹根部的鎘累積量與CK無顯著性差異。在OA處理下,香石竹根部的鎘累積量先增加后減小,在OA 5.0 mmol/kg時鎘累積量最大,顯著高于CK 108%。莖部的鎘累積量隨著EDTA濃度的升高先增加后減小,其中在EDTA 2.5和5.0 mmol/kg處理下分別顯著高出對照400%、600%；在CA和OA處理下,莖部的鎘累積量與對照無顯著性差異。在EDTA處理下葉部的鎘累積量均顯著高于對照260%～830%,并隨著EDTA濃度的增加先增加后減小。除CA 5.0 mmol/kg外, CA處理下的葉部鎘累積量均顯著高于對照,且在CA 10.0 mmol/kg時最大，達到7.29 μg。在OA處理下，葉部的鎘累積量均顯著高于對照,其中OA 2.5 mmol/kg時最大，達到6.52 μg。在EDTA 2.5、5.0和7.5 mmol/kg處理下，香石竹花中的鎘累積量均顯著高于CK的,以EDTA 5.0 mmol/kg處理下的最大，達7.27 μg；在OA和CA處理下花中的鎘累積量與CK無顯著性差異。隨著EDTA濃度的增加，整株的鎘累積量先增大后減小,顯著高出對照97%～423%,以在EDTA 5.0 mmol/kg時最大，達56.10 μg。除CA 10.0 mmol/kg時單株鎘累積量顯著高于對照86%外,其它CA處理下與CK無顯著性差異。在OA 10.0 mmol/kg處理下單株的鎘累積量與CK無顯著性差異,但在其它OA濃度處理下均顯著高于對照。可知, 在EDTA 5.0 mmol/kg處理下,香石竹對鎘的累積效果最佳；其次為OA<10 mmol/kg處理。

表2 螯合劑對香石竹植株對鎘的富集系數的影響

2.5 螯合劑對土壤中有效鎘含量的影響

從表3可以看出, EDTA、CA和OA的施用均提高了土壤中有效態鎘的含量。具體來說，隨著EDTA濃度的增加,土壤中有效態鎘的含量持續增加,在EDTA 10.0 mmol/kg時達到峰值5.78 mg/kg,是CK的4.15倍,是同濃度CA處理下的1.85倍。隨著CA濃度的增加,土壤中有效態鎘的含量持續增加,在CA 10.0 mmol/kg時最大,是CK的1.91倍。在OA處理下,土壤中的有效態鎘含量與CK無顯著性差異。

表3 施用EDTA、CA和OA對土壤有效鎘含量的影響 mg/kg

3 討論

土壤中的鎘主要以交換態鎘、專性吸附態鎘、鐵錳氧化結合態鎘和殘余態鎘的形態存在[7]。雖然土壤鎘污染對人體沒有直接性的接觸危害,但污染土壤中的鎘可以通過食物鏈進入人體，從而對人體造成較嚴重的危害。鎘是植物生長的非必需元素,當鎘進入植物體內并積累達到一定程度時,植物就會表現出受毒害癥狀,通常會出現生長遲緩、植株矮小、褪綠、產量下降、質量下降等。螯合誘導技術的基本原理是擾動污染物在土壤液相濃度和固相濃度之間的平衡。當螯合劑被投加到土壤中后,其與土壤中的重金屬發生螯合作用,形成水溶性的金屬-螯合劑絡合物,改變重金屬在土壤中的賦存形態,提高重金屬的生物有效性,進而可以強化植物對目標重金屬的吸收[8]。在本研究中,在3種螯合劑(EDTA、OA、CA)處理下,低濃度(≤5 mmol/kg)的EDTA、OA促進了植物的生長,其它處理均對香石竹的生長產生了不同程度的抑制作用,以高濃度螯合劑處理的抑制作用尤為顯著。這與部分學者得出的結果“高濃度螯合劑將會抑制植物的生長”一致。吳雪等[9]發現添加高濃度EDTA能顯著抑制蘆葦根系的生長；李艷艷[10]的研究發現紫茉莉和孔雀草的地上部與根部的生物量均隨著檸檬酸濃度的增加呈現先增加后下降的趨勢,分別在15和10 mmol/kg時達到最大;陳立等[11]的研究結果表明,在2.5、5.0、7.5 mmol/kg EDDS、OA和CA處理下，僅2.5 mmol/kg OA、CA處理使向日葵的生物量較CK略增,其它處理均使向日葵的生物量有不同程度的降低。螯合劑可以用于植物對重金屬污染土壤的修復[22]。蔣萍萍等[12]研究發現,加入不同濃度的螯合劑后,土壤可提取態Cd含量均高于對照。張磊[13]的研究結果表明,添加螯合劑顯著提高了土壤水溶態Cd的含量,且顯著促進了棉花植株Cd含量和地上部分的Cd積累量。這與本研究所得結果一致。劉婕等[14]研究發現,EDTA、檸檬酸均可促進反枝莧對土壤中Cu的富集,并強化Cu由根系向地上部分的轉移。香石竹是一種生物量大、易于種植的草本植物,在螯合劑EDTA和OA的處理下,重金屬鎘在其植株體內的轉運效率增大，這有利于鎘污染土壤修復的進行。

在不同螯合劑處理下,香石竹對鎘的吸收程度不同,植物通過根系吸收將重金屬從土壤中轉移到地上部的莖、葉等器官,植物各器官中的重金屬含量表明了植物修復重金屬效率的高低[15-16]。葉朝軍等[17]研究表明, EDTA可以有效地提高重金屬的生物有效性,強化植物修復重金屬污染土壤。吳俊鋒等[18]研究發現，在鉛脅迫下, EDTA在促進植物體內鉛的吸收和從根部到地上部的轉運效率方面要比檸檬酸更為有效。席梅竹[19]通過對5種螯合劑EDTA、EDDS、AES、ISA和PESA在促進植物吸收重金屬效率方面的對比研究發現,螯合劑對重金屬含量的影響在植株地上部的表現不如在根部明顯,除個別螯合劑處理下的個別元素外,地上部重金屬含量與對照差異并不顯著。羅蘭艷等[20]研究認為,在EDDS和EDTA存在的情況下,油菜根系Cd含量減少,地上部Cd含量與對照相比顯著增加, EDDS和EDTA能增強Cd從油菜根系到地上部的轉運。韓廿等[21]研究發現,施用螯合劑可影響油葵對Cd和As的吸收積累,但對油葵各器官的影響不同。李艷艷[10]研究表明,孔雀草各個部位的鎘含量隨檸檬酸濃度的增加而先降低再增加,這與本試驗的研究結果一致。

4 結論

在螯合劑EDTA、OA處理下,香石竹植株干重隨著濃度的增高先增大后減小。在CA處理下,香石竹植株干重隨著濃度的增高先減小后增大。在試驗設置濃度下,低濃度的EDTA和OA有助于香石竹的生長。

低濃度EDTA(≤5 mmol/kg)不僅有利于香石竹對鎘的富集，而且有助于鎘由地下部向地上部的轉移。OA對香石竹富集鎘的效果較CA好。

不同濃度的EDTA、CA和OA均不同程度地增加了土壤中有效態鎘的含量,促進了香石竹對土壤中有效態鎘的吸收。其中, EDTA較CA和OA的效果顯著,CA和OA的效果相似。