基于網絡藥理學探討通幽湯治療食管癌的作用機制

孫亞云 ，王若凡 ，張娟

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南省中醫院，河南 鄭州 450002

2018年全球癌癥統計數據顯示：食管癌是世界范圍內第七大惡性腫瘤，居癌癥相關死亡原因第六位[1]。食管癌是我國第六大惡性腫瘤，居癌癥相關死亡原因第四位[2]。最新發布的2020年消化系統癌癥預估新發病例及死亡病例中，食管癌分別位于第六位、第四位[3]。西醫治療食管癌主要是通過手術、放療、化療、介入等方式，中醫則主要通過口服中藥湯劑達到治療效果。食管癌屬于中醫“噎膈”、“噎塞”等范疇。多數食管癌患者在發病早、中期已有血瘀表現，部分患者的血瘀癥狀則貫穿于發病始終。通幽湯作為活血通幽的經典代表方劑，臨床上應用廣泛。目前，針對通幽湯，無論是臨床觀察還是實驗研究，都尚未明確指出其有效活性成分、體內作用靶點和作用機制。食管癌的高發病率、高死亡率及通幽湯治療食管癌的有效性都要求我們應進一步探索通幽湯治療食管癌的作用機理。

近年來，網絡藥理學平臺的系統、完整構建，為我們尋求通幽湯治療食管癌的作用機理提供了契機。網絡藥理學適用于中藥多成分、多靶點、多通路特點，對藥物、基因和疾病的相互作用網絡進行分析，了解中藥及其復方的作用機制，全面深入探究中藥與機體的相互作用關系[4]。本研究借助網絡藥理學平臺探討通幽湯治療食管癌的主要成分、作用靶點及信號通路，為該方的臨床應用及進一步的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究使用軟件及在線工具

本研究使用的軟件見表1。

1.2 通幽湯有效成分篩選

本研究借助TCMSP數據庫[5]、TCMID數據庫[6]、Batman-TCM數據庫[7]結合文獻查找對通幽湯中藥味桃仁、紅花、生地黃、熟地黃、當歸、升麻、甘草、檳榔進行化學成分檢索。依據藥代動力學參數（ADME），以口服生物利用度（OB）≥30%[8]、類藥性（DL）≥0.18[9]為條件進行篩選。

1.3 通幽湯“中藥-活性成分-預測靶點”網絡構建與分析

將收集得到的化學成分輸入TCMSP數據庫獲得化合物的預測蛋白靶點，利用UniProt數據庫[10]中UniProKBt的檢索功能將所有靶點名稱校正為官方名稱，建立“藥物-成分-靶點”數據信息庫。使用cytoscape3.7.2軟件進行網絡結構可視化處理，構建通幽湯“中藥-活性成分-預測靶點”網絡并根據度值篩選活性成分。

表1 本次研究使用軟件及在線工具Table 1 Software and online tools were used in this study

1.4 食管癌相關靶點篩選

本研究借助genecards數據庫[11]，以“esophageal carcinoma”或“esophageal cancer”為關鍵詞，對食管癌相關靶點進行收集并結合OMIM[12]、TTD[13]、DRUGBANK[14]數據庫補充相關靶點。根據經驗，若靶點過多則設定Score大于中位數的目標靶點為食管癌的潛在靶點。將以上4個疾病數據庫檢索結果合并，去除重復值，作為食管癌的預測靶點庫。

1.5 “藥物-疾病”靶點映射

通過FUNRICH 3.1.3軟件“Add dataset”功能將藥物有效活性成分對應靶點導入并命名為“成分靶點”，食管癌相關靶點導入并命名為“疾病靶點”，通過“Venn”功能進行映射，獲得通幽湯治療食管癌的潛在作用靶點，繪制韋恩圖。

1.6 共有靶點PPI網絡構建與分析

將“藥物-疾病”共有靶點導入在線STRING平臺，限定研究物種為“Homo sapiens”、“minimum required interaction score（≥0.9）”并且隱藏網絡中斷開的節點，其他參數保持默認設置，得到蛋白與蛋白相互作用信息，構建PPI網絡圖。在“Exports”下保存其TSV格式文件，將文件中的node1，node2，combined score信息導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制蛋白相互作用網絡后，進一步進行網絡拓撲結構分析。節點表示靶點，邊表示蛋白與蛋白之間相互作用，combined score值反映邊的粗細，節點degree值反映靶點大小及顏色深淺。Combined score值由小到大，則邊由細到粗。Degree值由小到大，則節點由小到大，顏色由淺至深。同時采用MCODE算法進行潛在蛋白質功能模塊分析，將K-Core設置2，將結果顯示score大于2的模塊根據打分進行聚類排序。

1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

Metascape平臺擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數據資料[15]。將130個“藥物-疾病”共有靶點錄入Metascape平臺進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。限定“Min Overlap：3”、“P Value Cutoff：0.01”、“Min Enrichment：1.5”。其中GO富集分析包括分子功能（Molecular function，MF），細胞組分（Cellular component，CC）和生物過程（Biological process，BP）三個部分。查閱相關資料，對所得到的涉及靶點較多的通路進行分析。借助EasyChar平臺對結果進行可視化。

1.8 “通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網絡的構建與分析

將Metascape平臺KEGG通路富集分析得到的前20條KEGG通路與通幽湯活性成分及靶點信息按照網絡文件和屬性文件進行excel文件格式的數據編排，上傳至Cytoscape 3.7.2軟件，構建“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網絡圖。運用CytoScape 3.7.2內置的“NetworkAnalyzer”工具分析成分、靶點、通路的網絡拓撲參數，包括連接度（Degree）、 介 度（Betweenness）、 緊 密 度（Closenesss）等，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

1.9 核心基因預后分析與差異驗證

Kaplan Meie-plotter是一種常用的基于EGA、TCGA和GEO數據庫的在線網站工具，用于評估基因對生存期的影響[16]。設定癌種為“Esophageal Adenocarcinoma、 Esophageal Squamous Cell Carcinoma”，選取“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網絡中靶點Degree值高于平均靶點Degree值的靶基因。將所得基因依次通過KM-plotter進行生存分析。篩選出對食管癌總生存期（Overall Survival，OS）有影響的基因，將p值＜0.05的基因進一步在GEPIA網站進行差異驗證。

2 結果

2.1 通幽湯“中藥-活性成分-預測靶點”網絡構建與分析

從TCMSP、TCMID、Batman-TCM數據庫及文獻中共獲取通幽湯8味藥161個活性成分，并查詢通幽湯化合物對應的靶標蛋白，利用UniProt數據庫將所有靶點名稱校正為官方名稱，刪除重復項后共預測靶標251個。方中各藥味活性成分和預測靶標數量見表2。使用Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡結構可視化處理，構建通幽湯“中藥-活性成分-預測靶點”網絡，如圖1。通過CytoScape 3.7.2內置的“Network Analyzer”進行網絡拓撲分析，根據度值篩選活性成分，度值排前10位的代表成分見表3。

2.2 食管癌相關靶點篩選

以“esophagealcarcinoma”為關鍵詞在genecards數據庫獲取疾病靶點6 107個，以“esophageal cancer”為關鍵詞在genecards數據庫獲取疾病靶點7055個。根據經驗若靶點過多則設定Score大于中位數的目標靶點為食管癌的潛在靶點。如genecards中“esophageal carcinoma”Score最大值為154.61，最小值為0.2，中位數為2.54，則設定Score＞2.54的靶點為食管癌的潛在靶點。結合OMIM、TTD、DRUGBANK數據庫補充相關靶點，合并4個數據庫后刪除重復值，最終得到1 378個食管癌相關靶點。

表2 通幽湯“中藥-成分-靶標”基本信息Table 2 Basic information of common targets of Tongyou Decoction

表3 通幽湯的核心活性成分Table 3 Core active ingredients of Tongyou Decoction

圖1 通幽湯“中藥-活性成分-預測靶點”網絡Figure 1 Network of Chinese medicine-active ingredients-prediction target of Tongyou Decoction

2.3 共有靶點PPI網絡構建與分析

通過FUNRICH3.1.3軟件“Add dataset”功能將成分靶點與疾病靶點經“Venn”功能進行映射，獲得通幽湯成分-食管癌共同靶點130個，如圖2。進而將靶點提交至String數據庫，獲得STRING平臺共有靶點蛋白相互作用信息，如圖3-A。保存其TSV格式文件，將文件中的node1，node2，combined score信息導入Cytoscape3.7.2軟件繪制蛋白相互作用（PPI）網絡，如圖3-B。進一步進行網絡拓撲結構分析，如圖3-C。該網絡共涉及125個節點，668條邊，網絡平均鄰居節點數為：10.688。共有48個靶蛋白Degree值高于平均值，其中AKT1、STAT3、TP53、JUN、MAPK1、MAPK3等靶點蛋白Degree值較大，表明與其他蛋白相互作用較強，因此這些蛋白在網絡中具有重要作用。同時采用MCODE算法進行潛在蛋白質功能模塊分析，將K-Core設置2，結果顯示score大于2的模塊根據打分的排序聚成7類，分析得到AKT1、TP53、BCL2、CCNB1等58個基因。篩選結果見圖3-D。

圖2 活性成分靶點與食管癌靶點venn圖Figure 2 Venn diagram of active component target and esophageal cancer target

2.4 GO富集分析及KEGG通路富集分析

將130個關鍵靶蛋白導入Metascape數據庫進行GO富集分析及KEGG通路富集分析，借助EasyChar平臺對結果進行可視化。其中生物過程（BP）涉及對無機物的反應、對有毒物質的反應、細胞對有機環化合物的反應、脂質細胞反應、細胞死亡的正向調節等；細胞組成（CC）涉及細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、膜筏、轉錄因子復合體、囊泡腔等；分子功能（MF）涉及蛋白激酶結合、轉錄因子結合、蛋白質均二聚活性、蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析涉及癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、弓形蟲病、丙型肝炎、p53信號通路、FoxO信號通路、癌癥中的轉錄失調、NF-κB信號通路、化學致癌作用等。根據p值排序，每個模塊前10位的條目見圖4A-D。

圖3 PPI篩選網絡圖Figure 3 PPI screening network diagram

2.5 “通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網絡的構建與分析

圖4 GO富集分析及KEGG通路富集分析Figure 4 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

運用CytoScape3.7.2構建“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網絡，如圖5。網絡共涉及237個節點和1 322條邊。通過CytoScape 3.7.2內置的“NetworkAnalyzer”功能分析通幽湯治療食管癌的網絡拓撲學參數，并根據Degree值篩選通幽湯治療食管癌的關鍵成分及核心作用靶點。Cytoscape網絡分析表明，槲皮素連接度（Degree）為148，介度（BetweennessCentrality）為 0.2 097 949，緊密度（ClosenessCentrality）為0.55 269 321，預測槲皮素為通幽湯治療食管癌的主要成分。其次為山柰酚（連接度為52，介度為0.03 152 119，緊密度為0.45 124 283）、木犀草素（連接度為38，介度為0.05 169 843，緊密度為0.47 294 589）、β-谷甾醇（連接度為33，介度為0.00 784 141，緊密度為0.42 369 838）。按度值排列前10位見表4。

PTGS2在網絡中的連接度為126，介度為0.31 799 445，緊密度為0.63 101 604，預測PTGS2為通幽湯治療食管癌的最主要靶點。HSP90AA1、PPARG、AR、NOS2、CDK2、GSK3B、MAPK14亦為相對重要靶點。根據p值進行排序，靶標通路富集結果前10位見表5。

2.6 核心基因預后分析與差異驗證結果

選取“通幽湯成分-食管癌靶點-通路”網絡中靶點Degree值高于平均Degree值的靶點共17個，進一步使用KM-plotter分析核心基因的預后信息，其中HSP90AA1、CDK2、AKT1、JUN與食管腺癌總生存期相關（P＜0.05），GSK3B、CHEK1、BCL2與食管鱗癌總生存期相關（P＜0.05），如圖6所示。進一步在GEPIA在線數據庫對以上7個基因進行食管癌癌組織與癌旁組織的差異表達驗證，結果顯示HSP90AA1、GSK3B、CHEK1基因在食管癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織（p＜0.05，紅色代表腫瘤組織，灰色代表癌旁組織），如圖7所示。

圖5 通幽湯成分-食管癌靶點-通路網絡圖Figure 5 Tongyou Decoction composition-esophageal cancer target-pathway network

3 討論

通幽湯出自《蘭室秘藏》卷下，由桃仁、紅花、生地黃、熟地黃、當歸、升麻、甘草、檳榔8味藥配伍而成。本方主治瘀血內停，血燥津枯，幽門不通之證，具有養血活血，潤燥通幽的功效。現代臨床研究表明，通幽湯或通幽湯聯合放化療、放射性125I粒子植入、中成藥等治療食管癌均能起到較好療效[17-21]。通幽湯“中藥-活性成分-預測靶點”網絡顯示：一味中藥可對應多個化合物，同一化合物可調控不同靶點，顯示了通幽湯發揮作用是通過多成分、多靶點的協同作用。

表4 通幽湯治療食管癌的核心活性成分Table 4 The core active ingredients of Tongyou Decoction in the treatment of esophageal cancer

表5 靶標通路富集結果Table 5 Enrichment results of target pathway

通幽湯治療食管癌的藥味及活性成分篩選：①藥味：前10位通幽湯治療食管癌的核心活性成分所對應的17個藥味中，紅花占7味，占比約41%。活性成分最高的槲皮素所對應的藥味亦為紅花。故初步推測紅花可能為通幽湯治療食管癌的關鍵藥味。臨床研究表明紅花提取物紅花黃色素可有效降低胸腔鏡食管癌根治術術后患者早期并發癥，減弱機體創傷的氧化應激反應，改善肺功能，提高臨床治療有效率[22]。②活性成分：根據Degree值進行排序，槲皮素連接度最高，預測槲皮素為通幽湯治療食管癌的主要成分。其次為山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等，這與通幽湯預測的核心活性成分具有一致性。食管癌相關基礎研究表明，槲皮素可抑制人食管癌Eca109細胞的增殖、遷移、侵襲及血管新生，又可誘導人食管癌Eca109細胞發生保護性自噬、促進其凋亡，呈時間和劑量依賴效應[23-25]。山柰酚通過靶向EGFR信號通路抑制食管鱗狀細胞癌的細胞增殖和糖酵解[26]。木犀草素可能通過誘導Eca109細胞凋亡，參與caspase3、caspase9 mRNA和蛋白的表達，從而起到促進細胞凋亡的作用[27]。

圖6 KM-plotter分析Figure 6 KM-plotter analysis

圖7 GEPIA分析Figure 7 GEPIA analysis

通幽湯治療食管癌的靶點主要集中在PTGS2，HSP90AA1亦為重要靶點之一。臨床研究表明前列腺素過氧化物酶-2（PTGS2）的酶活性與炎癥和腫瘤生長相關，是一種潛在的預后生物標志物[28]。盡管使用KM-plotter對PTGS2進行基因預后信息分析顯示：PTGS2與食管癌生存期無統計學意義，但回顧既往研究，PTGS2與食管癌的研究多集中在生存期方面，結論尚不相同，目前有：PTGS2的表達與食管癌的生存期無關[29]、PTGS2高表達不利于食管癌患者的生存[30]、PTGS2高表達與提高總體生存率和癌特異性生存率相關[31]等，故PTGS2能否作為食管癌預后性生物標志物仍是未來需進一步研究的方向。HSP90AA1與食管癌侵襲轉移相關，HSP90AA1下調表達使CE81T-4細胞周期阻滯于G0/G1期，促進凋亡，抑制增殖、侵襲和遷移能力[32]。KM-plotter分析亦顯示HSP90AA1與食管癌總生存期相關，并且HSP90AA1在食管癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織。

PPI網絡共涉及125個關鍵靶點，48個靶點Degree值高于平均值。使用MCODE算法，根據Cluster score值聚類排序進行潛在蛋白質功能模塊分析，score值最高的模塊涉及14個靶點，是最具有生物學意義的集合。該集合有2種含義，一為蛋白質復合體，即多個蛋白質共同組成復合體而后發揮生物學作用；二為功能模塊，即位于同一通路的蛋白質，其相互作用更加密切[33]。PPI網絡亦表明通幽湯多靶點治療食管癌的特點。

通幽湯治療食管癌的通路主要集中在癌癥通路（hsa05200）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（hsa04933）、前列腺癌（hsa05215）等。鐘珊等[34]研究發現ESCC組織/細胞中顯著降低的miR-3914和miR-8082與癌癥通路相關，其余兩者與食管癌尚無相關研究。就中醫病因病機而言，食管癌、糖尿病、前列腺癌病機均有陰虛血瘀表現，治療上均可使用通幽湯[35-37]進行治療，這充分體現了中醫辨證論治、異病同治的治療原則。就經絡循行而言，前列腺癌、食管癌皆為足厥陰肝經所循行，糖尿病則符合中醫“絡病”表現，絡脈亦可與肝經相連，故三者經絡循行相關。后續研究中可否通過陰虛血瘀的病因病機確定治則，使用針灸或穴位注射等方法治療疾病有待于進一步研究探索。

本研究借助網絡藥理學分析通幽湯治療食管癌的作用機制，結果表明通幽湯是通過多成分、多靶點、多通路的協同來發揮治療食管癌的作用。預測的活性成分、靶點及通路與大部分文獻報道相一致，說明網絡藥理學的研究方法具有較高可信度，能為挖掘中藥潛在價值提供可靠平臺。對于該研究中未提及的化合物、靶點及通路，可能原因：一、本與食管癌發生、發展、治療機制不相關；二、相關，但尚未發現。本研究現僅借助網絡藥理學平臺、基于生物信息學與數據庫進行分析，后續將在此基礎上進一步進行細胞學或動物學驗證，為臨床給藥提供可靠依據。