啟膈散聯合順鉑對與成纖維細胞共培養的食管癌EC9706細胞生長的影響

王朋輝，吳耀松，尚藝婉，孟丹華，李晨旭，李迎霞，楊聯河，陳玉龍

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.洛陽市中醫院，河南 洛陽 471000

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率在全球居第七位和第六位。我國每年約有26萬食管癌新發病例。食管癌預后欠佳，五年生存率不到30%[1，2]。因此，深入研究食管癌發生發展分子機制，可為食管癌治療提供思路及新靶點。目前，越來越多的學者在食管癌的診療中不僅關注食管癌細胞本身，更關注食管癌腫瘤微環境。腫瘤相關成纖維性細胞參與了腫瘤發展全過程，為食管癌細胞的增殖、侵襲等提供了適宜環境[3，4]。行氣化痰法及其代表方啟膈散在食管癌的治療中運用廣泛，本課題組前期研究顯示啟膈散聯合順鉑有較顯著的協同作用，能明顯抑制食管癌EC9706細胞生長，促進食管癌EC9706細胞凋亡及增加S期的阻滯率[5，6]，但在與成纖維細胞共培養條件下啟膈散是否仍具有很好的抑制食管癌細胞生長及與順鉑協同作用，仍未有相關研究報導。本文就此問題進行了研究，現報告如下。

1 材料

1.1 細胞株

食管癌EC9706細胞株由河南省方證信號傳導重點實驗室惠贈，人食管成纖維細胞HEF購自美國ScienCell細胞庫（貨號：#2730）

1.2 主要試劑

DMEM：F12=1∶1（中國 Boster公司批號20160522）、胎牛血清（美國Gemini公司，批號：A97E00G）、順鉑（美國Sigma公司，批號MKBG8465V），Annexin V-FITC/PI細胞雙染凋亡檢測試劑盒、PI周期試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）。

1.3 儀器設備

倒置顯微鏡（德國Laica公司）、高壓滅菌鍋（日本ALP公司）、低速離心機（湖南湘儀有限公司）、ELx-800型酶標儀（美國BIO-TEK公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）、CO2培養箱德國（Eppendorf公司）、FACSVantage SE型流式細胞儀（美國BD公司）、高速低溫離心機（美國Thermo公司）、紫外分光光度計（美國Thermo）。

2 方法

2.1 藥物制備

實驗藥物啟膈散參照《醫學正傳》組方，藥物組成與比例：丹參︰沙參︰茯苓︰川貝母（去心）︰杵頭糠︰砂仁殼︰郁金質量比為6︰6︰2︰3︰1︰1︰1；藥材均購自北京同仁堂。藥量按照上述比例稱取每味藥的對等克數，質量︰體積=1︰10，加入體積分數95%乙醇浸泡7 d，每日震蕩2次混勻。旋轉蒸發，濃縮藥液，上述濃縮液與乙酸乙酯體積比為2︰1進行萃取；然后濃縮、低溫真空干燥，最終出膏率為0.82%。二甲基亞砜（DMSO）充分溶解配置100 mg/mL的母液，0.22 μm過濾除菌，-20℃冰箱保存，備用。

2.2 細胞培養

將成纖維HEF和食管癌EC9796細胞于含10%胎牛血清的DMEM：F12=1︰1完全培養基。于37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，2～3 d換液、傳代。

2.3 啟膈散和順鉑及兩者聯合對共培養條件下食管癌EC9706細胞增殖的影響

將食管癌EC9706細胞以6×104/孔接種于24孔Transwell細胞培養板下室，成纖維細胞HEF以3×104/孔接種于24孔Transwell細胞培養板上室，5%CO2培養箱中靜置4h后將上室置于下室中，同時設置常規單獨EC9706細胞培養組，每組3個復孔，培養48 h，MTT（MTT溶液終濃度：0.5 mg/mL），500 μL/孔，37 ℃CO2培養箱中避光孵育4h，吸出上清，加入DMSO（600 μL/孔）緩慢搖床搖動15 min，酶標儀570 nm處測吸光度OD值。實驗重復3次。

以上條件，經濃度為10、20、40、80、160 μg/mL啟膈散乙酸乙酯提取物或0.5、1、2、4、8 μg/mL的順鉑處理48 h后，MTT比色法檢測不同培養條件下食管癌EC9706細胞對順鉑敏感性，概率法分別計算IC30及IC50值，。

啟膈散和順鉑聯合用藥，分為單獨順鉑IC30作用48h組，單獨啟膈散乙酸乙酯IC30作用48 h組，聯合用藥組（順鉑IC30先作用24 h后，再加入啟膈散乙酸乙酯IC30作用24 h）。

2.4 PI染液法檢測細胞周期

取常規培養對數生長期細胞，以3×106/瓶接種于10 cm2細胞瓶中，經不含血清的培養基同步化培養24 h。進行共培養和常規單獨培養，條件如上，藥物濃度同上。培養48 h后，收集食管癌細胞，PI染色30 min，過濾后流式細胞儀檢測細胞周期。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

細胞培養及分組同2.4。培養48h后，收集食管癌細胞1×106mL-1，預冷的PBS洗2遍。細胞重懸于 500 μL BufferA 中，加入 5 μL PI和 5 μL Annexin V-FITC染液染色，室溫孵育10～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。凋亡率=處理組-對照組。

2.6 統計學處理

應用SPSS20.0統計軟件進行數據分析，若數據符合正態性分布，采用ANOVA方差分析，數據以（均數±標準差）表示，P＜0.05有統計學意義。

3 結果

3.1 啟膈散乙酸乙酯對共培養條件下食管癌EC9706細胞活性影響（n=3，±s）

不同濃度啟膈散乙酸乙酯部位提取物對共培養條件下食管癌EC9706細胞有明顯的抑制作用和量效關系，成濃度劑量依賴性（P＜0.05）。

表1 啟膈散乙酸乙酯對共培養條件下食管癌EC9706細胞活性影響（n=3，±s）Table 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

表1 啟膈散乙酸乙酯對共培養條件下食管癌EC9706細胞活性影響（n=3，±s）Table 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

注：與單獨EC9706空白對照組比較，①P＜0.05

組別抑制率（%）0-4.03 24.45 26.90 44.66 69.15啟膈散乙酸乙酯（μg/mL）0 10 20 40 80 160 24 h OD值48 h OD值1 2 3 4 5 6 0.83±0.01 0.79±0.02①0.76±0.05①0.67±0.02①0.45±0.15①0.27±0.07①抑制率（%）0 4.82 8.43 19.28 45.79 67.47 0.88±0.09 0.84±0.14 0.66±0.11①0.62±0.10①0.47±0.05①0.26±0.01①

圖1 啟膈散乙酸乙酯對共培養條件下食管癌EC9706細胞活性影響Figure 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture

3.2 與成纖維細胞HEF共培養影響食管癌細胞EC9706對順鉑的敏感性

在順鉑相同濃度作用下，共培養條件下食管癌EC9706組的OD值明顯高于單獨培養食管癌EC9706組（P＜0.05）；單獨培養IC50為2.63±0.38，共培養為3.41±0.33，共培養條件下順鉑的IC50值明顯高于單獨培養食管癌EC9706組（P＜0.05）。結果見圖2。

表2 不同培養條件下順鉑對食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

表2 不同培養條件下順鉑對食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

注：與EC9706空白對照組比較，①P＜0.05；與單獨EC9706培養條件組比較，②P＜0.05；A：單獨EC9706組B：共培養條件組。

順鉑濃度（μg·mL-1）0 0.25 0.5 A組順鉑IC50 B組順鉑IC50 A組OD值0.48±0.06 0.46±0.02 0.44±0.07 0.38±0.12①0.27±0.02①0.08±0.01①B組OD值0.47±0.04 0.50±0.06 0.44±0.05①0.44±0.06①0.31±0.02①0.16±0.01①2.63±0.383.41±0.33②1 2 4

圖2 ：不同培養條件下順鉑對食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Figure 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

3.3 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用

與單獨順鉑IC30作用48 h組相比較，聯合用藥組OD值明顯減少（P＜0.05），聯合用藥有協同作用趨勢，順鉑組、啟膈散組、聯合用藥組對EC9706細胞的抑制率分別為22.97%、33.76%、46.35%。結果見表3

3.4 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對食管癌細胞EC9706的凋亡影響

與單獨培養的EC9706組相比較，共培養條件組總凋亡率降低，結果具有統計學意義（P＜0.05），晚期凋亡率下降明顯；與共培養模型組相比較，順鉑組明顯使EC9706早期凋亡率增加，而啟膈散乙酸乙酯組，聯合用藥組均使EC9706晚期凋亡率增加，差異有統計學意義（P＜0.05），其中以聯合用藥組使EC9706晚期凋亡率增加明顯（P＜0.05），但早期凋亡率差異不大，結果見表4，圖4、6。

表3 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用（n=3，±s）Table 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

表3 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用（n=3，±s）Table 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

注：與單獨EC9706空白對照組比較，①P＜0.05

組別空白對照組順鉑組啟膈散組聯合用藥組OD值0.94±0.01 0.72±0.02①0.62±0.08①0.51±0.06①抑制率（%）0 22.97 33.76 46.35

圖3 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder and cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture conditions

3.5 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞周期的影響

與單獨的EC9706組相比較，共培養模型組增加了S期的比例，結果具有統計學意義（P＜0.05）；與共培養模型組相比較，順鉑組，啟膈散乙酸乙酯組及聯合用藥組明顯降低了EC9706細胞G0/G1期的比例，而增加了EC9706細胞S期的比例，差異有統計學意義（P＜0.05），其中以聯合用藥組作用最明顯（P＜0.05）；結果見表5，圖5、7。

4 討論

在食管癌腫瘤微環境中，食管癌相關成纖維細胞中大量分泌的平滑肌激動蛋白和轉化生長因子、IL-6，具有明顯的促進腫瘤細胞發生發展的作用，能夠促進食管癌細胞增殖及侵襲，其分子機制可能與食管癌耐藥有關[7，8]。

表4 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響（n=3，±s）Table 4 Effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

表4 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響（n=3，±s）Table 4 Effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

注：與單獨EC9706組比較，①P＜0.05；與共培養條件模型組相比較，②P＜0.05

Control M D C CD2總凋亡率（%）33.51±3.11 21.04±8.03①35.30±12.89①②37.35±3.89②55.52±6.12②組別單獨EC9706組共培養條件組順鉑組啟膈散乙酸乙酯組聯合用藥組早期凋亡率（%）7.05±1.86 4.68±1.05 11.93±2.04②5.96±0.84 5.94±1.67晚期凋亡率（%）26.46±5.27 16.36±7.73 23.36±12.26 31.39±3.03②49.45±4.44②

圖4 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響Figure 4 Ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the influence of culture conditions of esophageal EC9706 cell apoptosis

圖5 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞周期的影響Figure 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the cell cycle of esophageal carcinoma EC9706 under co-culture conditions

表5 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞周期的影響（n=3，±s）Table 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on EC9706 cell cycle of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

表5 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞周期的影響（n=3，±s）Table 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on EC9706 cell cycle of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

注：與單獨EC9706組比較，①P＜0.05；與共培養條件模型組相比較，②P＜0.05。

Control M D C CD2 S期（%）33.53±3.30 35.08±1.70①50.01±6.71②67.58±6.71②76.58±1.07②組別單獨EC9706組共培養條件組順鉑組啟膈散組聯合用藥組G0/G1期（%）53.68±3.50 54.01±1.02 34.30±2.29②21.78±2.52②13.14±5.10②G2/M期（%）12.79±2.11 10.92±0.81 15.69±5.20 11.64±1.71 10.01±3.38

本文研究顯示，食管成纖維細胞可以促進食管癌細胞增殖，是否也可降低食管癌細胞對順鉑的敏感性，有待探究。本研究比較了單獨培養食管癌EC9706和成纖維細胞HEF與EC9706共培養條件下兩種不同培養方式對順鉑的敏感性作用異同。發現在順鉑相同濃度作用下，共培養條件下食管癌EC9706組的OD值明顯高于單獨培養食管癌EC9706組，說明在共培養條件下成纖維細胞HEF介導了食管癌EC9706的耐藥，降低了順鉑對食管癌EC9706細胞的敏感性，但其機制需要深入研究。

圖6 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響Figure 6 Effects of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture conditions

圖7 啟膈散乙酸乙酯聯合順鉑對共培養條件下食管癌EC9706細胞周期的影響Figure 7 Effects of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the cell cycle of esophageal carcinoma EC9706 under co-culture conditions

中醫藥有逆轉腫瘤耐藥和增加化療藥物敏感性的作用，而啟膈散聯合化療可以起到增效減毒效應[9，10]。我們前期研究顯示，在常氧和低氧情況下啟膈散聯合順鉑有明顯的協同作用，能明顯抑制食管癌EC9706細胞生長[5，6]。本文研究顯示，啟膈散乙酸乙酯部位聯合順鉑可以更好地抑制與成纖維細胞共培養條件下腫瘤細胞生長，具有一定協同作用。

細胞凋亡障礙、凋亡抑制都會導致腫瘤的發生，因此直接誘導腫瘤細胞凋亡或通過拮抗凋亡抑制因子來誘導凋亡都是治療腫瘤很好的切入點，包括啟膈散在內的許多中藥方劑也具有一定誘導腫瘤細胞凋亡作用[11-13]。本實驗結果顯示，與單獨培養的食管癌EC9706組相比較，共培養條件組下調了總的凋亡率，以下調晚期凋亡率較為明顯。啟膈散聯合順鉑比順鉑單獨應用時凋亡率明顯升高，啟膈散在一定程度上能夠增強順鉑誘導EC9706凋亡的能力，但是其機制還需后續實驗來進行探討。

細胞周期是細胞完成一次完整的有絲分裂的過程，主要分為間期G1期（前期準備合成DNA單倍體期）、S期（DNA合成期）、G2期（合成蛋白質完成DNA復制的二倍體期）、有絲分裂期M期和靜息狀態G0期。腫瘤細胞存在周期調節失衡，很多研究都有報道中藥可以通過調節細胞周期起到治療腫瘤中作用[11，14，15]。本研究顯示，與單獨的EC9706組相比較，共培養模型組上調了S期的比例，使細胞增殖更快。順鉑組，啟膈散乙酸乙酯組及聯合用藥組明顯降低了EC9706細胞G0/G1期的比例，而增加了EC9706細胞S期的比例。說明在S期受到了藥物阻滯的影響。因此，啟膈散乙酸乙酯部位增強EC9706細胞對順鉑的敏感性與該結果有關。

本研究結果提示，啟膈散可抑制與成纖維細胞共培養條件下的食管癌細胞增殖、誘導凋亡，干預細胞周期，與順鉑聯合應用，具有一定增效作用。