白藜蘆醇聯(lián)用紫杉醇對(duì)食管癌EC109細(xì)胞凋亡的影響

劉曉潔，李永梅，霍峻鋒，趙勁竹，董亞龍，周凱瑞，張雪燕，李蕾蕾，王淙

1.鄭州大學(xué)藥物研究院，河南 鄭州 450001；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264000；3.河南省新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

食管癌是一種消化道惡性腫瘤，其惡性程度高，在全球范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡人數(shù)中排第六位[1]。多數(shù)患者在確診時(shí)就已經(jīng)是晚期，食管癌的五年生存率不足30%[2]。目前，化療是食管癌的主要治療手段之一。

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）具有廣泛的抗腫瘤活性，對(duì)卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和食管癌等惡性腫瘤的早期治療具有一定的效果[3，4]。臨床常用PTX治療食管癌，但其具有較強(qiáng)的毒副作用并易產(chǎn)生耐藥性。因此，聯(lián)合用藥成為近年來研究的熱點(diǎn)。但聯(lián)合用藥也可能會(huì)產(chǎn)生一定的拮抗作用。研究發(fā)現(xiàn)，在某些惡性腫瘤中，白藜蘆醇聯(lián)用紫杉醇具有協(xié)同作用[5，6]。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）在結(jié)構(gòu)上類似于二苯乙烯，是一種多酚類植物抗毒素，存在于多種植物和草藥中，如葡萄、藍(lán)莓、桑葚、花生、虎杖等[7]。其具有多種藥理學(xué)和生理學(xué)活性，包括抑制腫瘤、心血管保護(hù)作用、減少血小板凝集以及化學(xué)預(yù)防作用[8-11]。目前，有部分臨床醫(yī)生鼓勵(lì)患者服用含有白藜蘆醇的膳食補(bǔ)充劑或食物以提高整體的藥物療效。在臨床治療中，許多天然化合物與藥物同時(shí)使用后，可以改變藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體特性從而影響藥代動(dòng)力學(xué)。本課題主要探究白藜蘆醇對(duì)紫杉醇抗腫瘤作用的影響，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞以及主要試劑

PTX和Res購(gòu)自海南康力制藥有限公司。二甲基亞砜（DMSO）和核糖核酸酶購(gòu)自索萊寶（中國(guó)北京）。溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT），羅丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）購(gòu)自Sigama（美國(guó)密蘇里州圣路易斯市）。Hoechst 33258（雙苯酰亞胺）購(gòu)自碧云天公司。食管癌EC109細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將EC109細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中后，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d進(jìn)行一次傳代，隔天更換一次培養(yǎng)基以供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 使用MTT法檢測(cè)各個(gè)用藥組的細(xì)胞活力

將EC109細(xì)胞接種于96孔板中，孵育過夜。將不含藥物的培養(yǎng)基加入對(duì)照孔中，用PTX和Res單獨(dú)使用以及不同濃度的PTX和Res組合處理細(xì)胞48 h，然后每孔加入20 μlMTT。4 h后吸去96孔板中的溶液，每孔加入150 μLDMSO。搖床上震蕩10 min。使用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取每孔的吸光度。

1.4 結(jié)晶紫染色檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力

將EC109細(xì)胞接種于6孔板中每孔鋪1 000個(gè)細(xì)胞。隔夜培養(yǎng)后，使用不同組別的藥物處理6孔板中的細(xì)胞48 h。棄去含藥物的培養(yǎng)基并加入全新培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞培養(yǎng)7天，期間隔天換液。7天后棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗2次，加1 mL甲醇固定30 min，棄去固定液，PBS洗2次，每孔加入2 mL 1%結(jié)晶紫染液，染色30 min。棄去染液，PBS洗3次。室溫自然晾干。Image J計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。相機(jī)拍攝集落圖像。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.5 Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞核的變化情況

將細(xì)胞接種在提前放入無菌玻璃片的6孔板中，隔夜培養(yǎng)后，使用不同組別的藥物處理24 h。藥物處理后，棄去藥液，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗6孔板，Hoechst 33258避光染色30 min。PBS洗2次，充分洗去多余染料，小心取出玻璃片，蓋在蓋破片上，用濾紙吸走周邊殘余液體，熒光顯微鏡觀察拍照。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

通過流式細(xì)胞儀用AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒分析細(xì)胞凋亡。將EC109細(xì)胞接種在6孔板中貼壁，并用藥物處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入Binding Buffer，然后加入1 μL Annexin V-FITC染液，避光染色10 min，每組樣品加入PI染色液1 μL，避光染色5 min。加入適量PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃，渦旋，處理完樣品后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組樣品中細(xì)胞凋亡百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 羅丹明123（Rh123）外排實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rh123蓄積情況

將EC109細(xì)胞接種于6孔板中，孵育過夜。藥物處理后繼續(xù)孵育24 h。隨后，加入用新鮮培養(yǎng)基配制的1 μg/mL Rh123溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。收集細(xì)胞，PBS洗兩次。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)羅丹明熒光強(qiáng)度。

1.8 HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PTX含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中。根據(jù)藥物的添加劑量分為四組：空白對(duì)照，PTX單用組（1，3 μg/mL PTX）、Res單用組（25 μM Res）、聯(lián)用組（1 μg/mL PTX+25 μM Res，3 μg/mL PTX+25 μM Res）。用不同組別的藥物處理細(xì)胞2 h，收集細(xì)胞，然后用PBS洗滌，離心并重懸在1 mL PBS中。用細(xì)胞破碎器破碎細(xì)胞。每管樣品加6 mL乙酸乙酯沉淀，渦旋5 min。4950 rpm，4℃，離心15 min。取上清5 mL，用氮?dú)獯祾邇x吹干。將每個(gè)樣品重新溶解在100 μL甲醇溶液中，并在4℃下以11 500 rpm離心細(xì)胞15 min，然后通過HPLC進(jìn)行檢測(cè)。隨后，用70 μL上清液用于定量分析。使用Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)，分析樣品，所述系統(tǒng)包括四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器和UV檢測(cè)器。使用Kromasil C18色譜柱（150×4.6 mm，5 μm，Diamonsil）進(jìn)行分離。流速為1.0 mL/min；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水=35∶56∶39；檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Res降低PTX在EC109細(xì)胞中的細(xì)胞毒作用

為了測(cè)量Res和PTX單用和聯(lián)合用藥的細(xì)胞毒性，用不同濃度的PTX（10，30，60和120 nmol/L），Res（5，10和25 μmol/L）處理EC 109細(xì)胞48 h。結(jié)果如表1及圖1所示。PTX在濃度為10、30、60和120 nmol/L時(shí)可顯著抑制EC109細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴性。與單用PTX相比，三種不同濃度的Res對(duì)EC109細(xì)胞增殖均沒有明顯的抑制作用。然而，PTX在聯(lián)用Res時(shí)，Res顯著減弱了PTX對(duì)EC109細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。通過CompuSyn軟件和Chou-Talalay方法對(duì)Res和PTX的聯(lián)用指數(shù)（CI）進(jìn)行評(píng)估[12]，CI＜1表示協(xié)同作用，CI＞1表示拮抗作用，CI=1表示加和作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同組合濃度中，Res聯(lián)用PTX的CI值均大于1，如圖2所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇25 μM Res聯(lián)用60 nM PTX用于后期研究。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

為了觀察藥物處理引起的形態(tài)變化，在PTX濃度為60 nM，Res濃度為25 μM時(shí)，以不同組合對(duì)EC109細(xì)胞進(jìn)行處理。結(jié)果如圖3所示。空白對(duì)照組中EC109細(xì)胞粘附狀態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)良好，具有清晰的邊界和不規(guī)則形狀。用25 μMRes處理后，EC109細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)和形狀與空白對(duì)照組相比沒有顯著變化。當(dāng)用60 nM PTX處理時(shí)，細(xì)胞變圓，體積減小，細(xì)胞漂浮，大多數(shù)細(xì)胞經(jīng)歷了類似于細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。當(dāng)用PTX和Res同時(shí)處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞形態(tài)又趨于正常，細(xì)胞數(shù)顯著增加，細(xì)胞碎片減少。

表1 PTX與Res聯(lián)用對(duì)EC109細(xì)胞細(xì)胞活力的影響（%）（n=3）Table 1 Effect of PTX combined with Res on EC109 cell viability（%）（n=3）

圖1 PTX與Res聯(lián)用對(duì)EC109細(xì)胞細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of PTX combined with Res on EC109 cell viability

圖2 不同藥物處理組中的聯(lián)合用藥指數(shù)Figure 2 Combination index in different drug treatment groups

圖3 不同藥物處理組的細(xì)胞形態(tài)（200×）Figure 3 Cell morphology in different drug treatment groups（200×）

2.3 Res減少PTX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

以上結(jié)果表明，Res顯著削弱了PTX在EC109細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTX處理過的組別中，幾乎沒有觀察到細(xì)胞克隆所形成的集落，克隆形成率為（10.81±1.24%）。當(dāng)用Res聯(lián)合PTX處理細(xì)胞時(shí)，EC109的克隆形成能力相較于單獨(dú)使用PTX處理時(shí)顯著增強(qiáng)，且克隆形成率增加至（18.81±2.91%），見表2。

表2 不同藥物處理組中的克隆形成率Table 2 Colony formation ratein different drug treatment groups

通過Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)EC109細(xì)胞的凋亡。Hoechst 33258染色用于觀察形態(tài)學(xué)變化，Annexin V和PI染色用于研究細(xì)胞凋亡率。不同藥物處理組的EC109細(xì)胞用Hoechst 33258染色并在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4所示。在空白對(duì)照組中觀察到細(xì)胞核中的藍(lán)色熒光較為均勻。用60nM PTX處理后，觀察到細(xì)胞核碎裂和明顯的凋亡小體。在25 μM Res處理組中，只有少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出核染色質(zhì)凝聚和凋亡小體。然而，在用60 nM PTX與25 μM Res聯(lián)用處理后，與單用PTX處理組相比，凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著降低。

圖4 不同藥物處理組中細(xì)胞凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化（200×）Figure 4 Morphological changes related to apoptosis in different drug treatment groups（200×）

Annexin V/PI凋亡試劑盒用于檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比，如表3及圖5所示。在EC109細(xì)胞中，單用60 nM PTX組可引起細(xì)胞凋亡，凋亡率為（39.8±5.67%）。單用25 μM Res組中凋亡率為（14.1±2.53%）。然而與單用PTX對(duì)比，聯(lián)合Res用藥組的細(xì)胞凋亡率明顯下降，凋亡率為（22±3.99%）。這些結(jié)果表明，在一定濃度下，Res可拮抗PTX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。

2.4 Res與PTX聯(lián)用可增強(qiáng)P-gp活性

Rh123是一種黃綠色熒光染料，是P-gp跨膜蛋白的特異性底物，在低濃度下無細(xì)胞毒性[13]。若P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)，Rh123的攝取將減少，細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度將降低。使用FlowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。細(xì)胞內(nèi)積累的熒光強(qiáng)度顯示，與單用PTX相比，組合組中平均熒光強(qiáng)度降低2.02倍。P-gp可介導(dǎo)Rh123積累量的變化。結(jié)果表明，Res與PTX聯(lián)用時(shí)通過增強(qiáng)P-gp活性降低了EC109細(xì)胞中的PTX積累。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

2.5 Res減少細(xì)胞內(nèi)PTX的積累

通過HPLC檢測(cè)不同用藥組中細(xì)胞內(nèi)PTX的積累濃度。結(jié)果如表5和圖6所示。短箭頭標(biāo)識(shí)的為PTX的吸收峰，保留時(shí)間為6.99 min。利用所用的色譜條件，可以分離細(xì)胞內(nèi)的PTX和內(nèi)源性物質(zhì)，沒有雜質(zhì)干擾。1 μg/mL和3 μg/mL PTX與25 μM Res聯(lián)用組均比PTX單用組細(xì)胞內(nèi)PTX的含量低。結(jié)果表明，Res減少了EC190細(xì)胞中PTX的積累。

表3 不同藥物處理組中的細(xì)胞凋亡率Table 3 Apoptosis rate in different drug treatment groups

3 討論

圖5 不同藥物處理組細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 5 Apoptosis results of different drug treatment groups

表4 不同藥物處理組的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度Table 4 Average fluorescence intensity of cells in different drug treatment groups

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其治療方案較多，在很多情況下藥物聯(lián)用的治療方案是有效的，但也存在藥物之間的拮抗作用。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示，PTX和Res之間的相互作用降低了PTX抑制食管癌的療效。通過HPLC實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Res可降低PTX在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，但是Res拮抗PTX的更深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

來自蔬菜和水果的天然化合物通常被認(rèn)為是安全的，很多研究也表明其可降低患癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，合理的膳食補(bǔ)充劑、中草藥可與處方藥物同時(shí)使用。Res作為惡性腫瘤患者膳食的佐劑，可能與藥物具有相互作用。此外，還要考慮來自食物中Res在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄特性，才能確定惡性腫瘤患者在使用PTX時(shí)能否能同時(shí)補(bǔ)充Res。然而，藥物與植物化學(xué)物質(zhì)之間相互作用的研究太少。食物成分對(duì)P-gp等藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的影響尚未得到廣泛研究[14]。有研究在膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中觀察到Res和PTX聯(lián)用會(huì)抑制PTX的抗腫瘤作用，且在乳腺癌的研究中，通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Res聯(lián)用PTX會(huì)降低PTX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[15，16]。基于上述研究，食管癌患者在使用PTX治療期間，食用含有Res的食物似有降低PTX藥效的風(fēng)險(xiǎn)，然而這一理論在未來仍需體內(nèi)和臨床的進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 不同藥物處理組細(xì)胞內(nèi)PTX的積累濃度Table 5 Accumulated concentration of PTX in cells of different drug treatment groups

圖6 不同藥物處理組中PTX的吸收峰面積Figure 6 The area of PTX absorption peak in different drug treatment groups