子宮內(nèi)膜癌組織中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)情況及與患者免疫功能和微衛(wèi)星不穩(wěn)定的關(guān)系

于文亮，潘長清，鄭茜文

綿陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000

子宮內(nèi)膜癌是一類常見的婦科惡性腫瘤，研究顯示其發(fā)病率居全部婦科惡性腫瘤的首位[1-2]。國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2015年中國子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例超過6萬例，發(fā)病率僅次于宮頸癌[3]。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展所處的內(nèi)外環(huán)境，其在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中均具有重要意義[4-6]。腫瘤微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞，對(duì)患者預(yù)后具有重要意義。影響腫瘤微環(huán)境淋巴細(xì)胞浸潤水平的因素十分復(fù)雜，臨床上認(rèn)為新抗原的產(chǎn)生可能是其機(jī)制之一，而錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白與新抗原的產(chǎn)生密切相關(guān)[7]。有研究表明，存在MMR蛋白缺失的結(jié)直腸癌組織中淋巴細(xì)胞浸潤水平顯著高于MMR蛋白表達(dá)的結(jié)直腸癌組織[8]，但目前尚無研究報(bào)道在子宮內(nèi)膜癌中是否存在相似的現(xiàn)象。自1981年首次提出微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）的概念后，大量研究者關(guān)注其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并探討其與MMR蛋白表達(dá)的相關(guān)性，但目前關(guān)于其與子宮內(nèi)膜癌的研究報(bào)道較少。基于此，本研究通過分析子宮內(nèi)膜癌中常見的4種MMR蛋白（PMS2、MLH1、MSH2、MSH6）的表達(dá)情況，并探討MMR蛋白表達(dá)情況與患者免疫功能及MSI的關(guān)系，旨在為臨床上評(píng)價(jià)患者預(yù)后提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011年3月至2018年3月于綿陽市中心醫(yī)院確診的82例子宮內(nèi)膜癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查診斷為子宮內(nèi)膜癌；②在確診前半年內(nèi)未接受過相應(yīng)的腫瘤治療或激素治療；③未合并其他嚴(yán)重疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病；②依從性差；③既往有子宮或?qū)m頸手術(shù)史。82例患者的年齡為31～59歲，平均年齡為（43.8±5.4）歲；非子宮內(nèi)膜腺癌8例（漿細(xì)胞癌5例，透明細(xì)胞癌3例），子宮內(nèi)膜腺癌74例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ期55例，Ⅱ期13例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例。采集患者的病理組織制成石蠟標(biāo)本，并分為2份，一份用于免疫組織化學(xué)染色，另一份用于提取DNA并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），同時(shí)采集患者的正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 將組織蠟塊連續(xù)切取3～5 μm厚切片，采用免疫組化Envision二步法進(jìn)行檢測(cè)。切片通過脫水和水化后，進(jìn)行熱修復(fù)，然后加入3%H2O2溶液避光孵育20 min。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3次，每次5 min。加入一抗溶液（MLH1抗體稀釋度為1∶50，MSH2抗體稀釋度為1∶200，MSH6抗體稀釋度為1∶150，PMS2 抗體稀釋度為1∶50，CD4+抗體稀釋度為 1∶200，CD8+抗體稀釋度為 1∶150），置于4℃冰箱中避光孵育過夜。PBS清洗3次，每次5 min，加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育30 min。PBS清洗3次，每次5 min。通過現(xiàn)配的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。采用已知的陽性片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 PCR 提取腫瘤組織DNA，檢測(cè)5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，引物序列購自北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司（表1）。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性15 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸25 min。4℃保存。將擴(kuò)增后的微衛(wèi)星片段經(jīng)95℃變性5 min后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，采用Gene Mapper4.1對(duì)微衛(wèi)星片段進(jìn)行分析。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 MMR蛋白表達(dá)缺失判定 MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達(dá)定位于細(xì)胞核，黃色或棕褐色為陽性，陰性即為表達(dá)缺失。判讀結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意內(nèi)對(duì)照的選擇，非腫瘤性的內(nèi)膜間質(zhì)、腺體及淋巴細(xì)胞核應(yīng)棕黃色陽性著色。只有在內(nèi)對(duì)照陽性背景下的腫瘤細(xì)胞核的表達(dá)完全缺失才能認(rèn)為有效，此外還應(yīng)注意對(duì)腫瘤組織區(qū)域進(jìn)行評(píng)估，而不應(yīng)選擇非腫瘤區(qū)域如增殖癥區(qū)域[9-10]。

表1 MSI位點(diǎn)的引物序列

1.3.2 T淋巴細(xì)胞浸潤情況 CD4+和CD8+的表達(dá)定位于淋巴細(xì)胞膜，棕黃色為陽性。每張切片隨機(jī)檢閱至少5個(gè)高倍鏡（×400）視野，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。取5個(gè)區(qū)域淋巴細(xì)胞數(shù)平均值。

1.3.3 MSI 陽性判定 腫瘤組織和同一患者的正常組織DNA在同一條件下電泳，若出現(xiàn)完全一致的電泳條帶，則為MSI陰性，若出現(xiàn)條帶的移動(dòng)、缺失或額外條帶，則為MSI陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR 蛋白表達(dá)缺失情況

82例子宮內(nèi)膜癌患者中，PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表達(dá)缺失例數(shù)分別為8例、7例、6例和13例，蛋白表達(dá)缺失率分別為9.8%、8.5%、7.3%、15.9%。總蛋白表達(dá)缺失率為35.4%（29/82），其中單個(gè)蛋白缺失24例，2個(gè)蛋白聯(lián)合缺失5例（3例MLH1/PMS2蛋白缺失，2例MSH2/MSH6蛋白缺失）。

2.2 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失情況的比較

不同F(xiàn)IGO分期、浸潤深度子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。年齡＞50歲、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率分別明顯高于年齡≤50歲、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。子宮內(nèi)膜腺癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于非子宮內(nèi)膜腺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失情況的比較（n=82）

2.3 MMR 蛋白表達(dá)缺失和未缺失子宮內(nèi)膜癌患者中CD4+及CD8+水平的比較

MMR蛋白表達(dá)缺失患者的CD4+水平為（74.27±10.26）%，明顯高于MMR蛋白表達(dá)未缺失患者的（35.91±8.42）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.237，P＜0.01）；MMR蛋白表達(dá)缺失患者的CD8+水平為（70.31±6.32）%，明顯高于MMR蛋白表達(dá)未缺失患者的（35.28±10.97）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.341，P＜0.01）。

2.4 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MSI發(fā)生情況的比較

82例患者中，MSI陽性17例，陽性率為20.73%。年齡＞50歲子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽性率高于年齡≤50歲的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽性率高于非子宮內(nèi)膜腺癌患者，低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽性率低于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同F(xiàn)IGO分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

2.5 MSI與MMR 蛋白表達(dá)的關(guān)系

17例MSI陽性患者中，MMR蛋白表達(dá)缺失15例，缺失率為88.24%，65例MSI陰性患者中，MMR蛋白表達(dá)缺失14例，缺失率為21.54%。MSI陽性患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于MSI陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.225，P＜0.01）。

表3 不同臨床特征子宮內(nèi)膜癌患者中MSI情況的比較（n=82）

3 討論

MMR基因具有保守性，而這一特性在基因組的穩(wěn)定性以及DNA復(fù)制的忠誠性中具有重要意義。突變的MMR蛋白可能會(huì)增加腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其可能的機(jī)制為突變導(dǎo)致MSI或錯(cuò)誤復(fù)制引起基因組不穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)癌基因與抑癌基因異常表達(dá)，最終導(dǎo)致某些細(xì)胞的無序及無限制增殖[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中MMR基因突變率較高，其可能的原因?yàn)楫?dāng)MMR基因發(fā)生突變時(shí)，MMR蛋白表達(dá)過低或缺失，造成MMR修復(fù)功能障礙，而由于機(jī)體難以及時(shí)修復(fù)DNA復(fù)制過程中的異常，從而導(dǎo)致“滑鏈錯(cuò)配”、復(fù)制差錯(cuò)、染色體互換不均勻等的發(fā)生，造成微衛(wèi)星DNA的長度改變，引發(fā)MSI，最終對(duì)細(xì)胞的正常增殖造成一定影響，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有利環(huán)境，同時(shí)癌基因和抑癌基因異常表達(dá)也會(huì)誘發(fā)腫瘤組織的形成[13-14]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，具有MMR基因突變的女性子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為40%～60%，而在正常人群中，這一比例僅約2.3%[15]。子宮內(nèi)膜癌組織中不同MMR蛋白表達(dá)的缺失率不同，MLH1蛋白表達(dá)缺失率為24%～28%，MLH2為7%～8%，MLH6為6%～21%，PMS2為28%～40%[16-17]。本研究結(jié)果顯示，82例子宮內(nèi)膜癌組織中，PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表達(dá)缺失率分別為9.8%、8.5%、7.3%、15.9%，總蛋白表達(dá)缺失率為35.4%，與上述研究結(jié)果較為一致。

影響MMR蛋白表達(dá)缺失的因素十分復(fù)雜，有研究報(bào)道，相較于年齡低于50歲的子宮內(nèi)膜癌患者，年齡超過50歲的子宮內(nèi)膜癌患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)缺失率更高。本研究結(jié)果顯示，年齡＞50歲、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率分別明顯高于年齡≤50歲、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。晉薇等[18]研究顯示，高FIGO分期、深肌層浸潤以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)缺失率較高。本研究結(jié)果顯示，MMR蛋白表達(dá)缺失均發(fā)生在子宮內(nèi)膜腺癌患者中，不同F(xiàn)IGO分期、浸潤深度子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與上述研究結(jié)果不同，可能與人種和地域因素有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率明顯高于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

MSI是由于機(jī)體MMR系統(tǒng)喪失導(dǎo)致復(fù)制錯(cuò)誤的結(jié)果，常見于遺傳性腫瘤，在散發(fā)性腫瘤中也存在一定比例的MSI陽性率。有研究報(bào)道，MSI與患者性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤浸潤深度均無相關(guān)性。彭俊玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MSI與散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的年齡有關(guān)；而趙巖等[20]研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中MSI與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度無關(guān)，但MSI更傾向發(fā)生于分化程度高及子宮內(nèi)膜腺癌組織中。本研究結(jié)果顯示，年齡＞50歲子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽性率高于年齡≤50歲的患者，子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽性率高于非子宮內(nèi)膜腺癌患者，低分化子宮內(nèi)膜腺癌患者的MSI陽性率低于中分化和高分化子宮內(nèi)膜腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同F(xiàn)IGO分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況子宮內(nèi)膜癌患者的MSI陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

研究認(rèn)為，MMR蛋白表達(dá)缺失的患者往往預(yù)后較好，其可能的機(jī)制為MMR蛋白表達(dá)缺失的組織中，微衛(wèi)星序列突變率上升，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生新的肽段，而其中一些肽段作為新抗原可被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并處理，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞浸潤增多[21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌以及非小細(xì)胞肺癌中，具有MMR蛋白表達(dá)缺失的患者淋巴細(xì)胞浸潤有所增加[9]，而MSI與MMR蛋白表達(dá)缺失密切相關(guān)[19-20]。張學(xué)華等[22]研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達(dá)缺失子宮內(nèi)膜癌患者中CD4+的水平顯著高于MMR蛋白表達(dá)未缺失的患者。本研究結(jié)果顯示，MMR蛋白表達(dá)缺失患者的CD4+、CD8+水平均明顯高于MMR蛋白表達(dá)未缺失的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MSI陽性患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率為88.24%，明顯高于MSI陰性患者的21.54%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明MMR蛋白表達(dá)缺失的子宮內(nèi)膜癌組織中有大量免疫細(xì)胞浸潤，患者的免疫功能有所提高，而MMR蛋白表達(dá)缺失可能參與MSI的發(fā)生，提示其可作為評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的指標(biāo)。然而，本研究具有一定的局限性，樣本量較小，且未對(duì)不同缺失蛋白的病例進(jìn)行分層分析。因此，仍需加大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，年齡＞50歲、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者中MMR蛋白表達(dá)缺失率較高。MMR蛋白表達(dá)缺失的組織中有大量免疫細(xì)胞浸潤，患者的免疫功能有所提高。