Wee1激酶作為腫瘤治療靶點的研究進展△

劉智慧，孟峻

1內蒙古醫(yī)科大學研究生學院，呼和浩特 010000

2內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010000

研究表明，細胞修復受損傷的DNA是通過細胞周期檢查點實現(xiàn)的[1]。在正常細胞中，受損的DNA通常于G1/S期檢查點進行修復，而大多數(shù)惡性腫瘤細胞于G1/S期檢查點存在修復缺陷，主要與TP53基因的失活有關。因此，在多數(shù)情況下，腫瘤細胞會依賴G2/M期檢查點來修復受損的DNA。G2/M期檢查點主要依賴于Wee1蛋白激酶和細胞分裂周期因子25（cell division cyclin 25，CDC25）對細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1，又稱CDC2）進行翻譯后修飾。Wee1在第15位酪氨酸殘基（tyrosine 15，Y15）處磷酸化CDK1，在DNA復制過程中造成G2/M期阻滯[2]。上述分子事件為細胞有絲分裂前的DNA修復提供了檢查點，但在DNA損傷的背景下抑制細胞周期檢查點會導致?lián)p傷持續(xù)，最終導致細胞凋亡，這是無法彌補的遺傳損傷。早期臨床研究主要集中在DNA損傷劑存在的情況下調節(jié)Wee1的活性和廢除G2期DNA損傷修復檢查點，利用有絲分裂災難的概念作為抗腫瘤活性的機制。體外研究表明，Wee1在穩(wěn)定復制叉和同源重組修復中也起著重要作用[3]。Wee1在DNA修復中發(fā)揮了更大的作用，進一步支持了其作為惡性腫瘤治療中可行治療靶點的有效性。

1 Wee1在細胞周期和DNA 損傷修復中的作用

細胞周期檢查點與細胞周期阻滯和DNA損傷反應的關系密切，對修復和維持基因組的完整性具有重要意義。p53主要通過ATM（ATR）/CHK1（CHK2）-p53/MDM2-p21通路誘導持續(xù)或永久性的G1期阻滯。但是，目前研究表明，多數(shù)腫瘤存在p53基因的突變和缺失，這就更加依賴于G2/M期的檢查點，而Wee1是G2/M期阻滯的關鍵激酶[4]。Wee1通過磷酸化CDK1、調節(jié)CDK1/細胞周期蛋白B（cyclin B）復合物的活性，從而實現(xiàn)對細胞周期的調控。作為G2/M期檢查點的組成部分，Wee1決定進入有絲分裂的時間點，并抑制細胞周期的早期進展，同時也參與細胞對DNA的損傷反應[5-6]。Wee1還通過調節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）的磷酸化狀態(tài)維持DNA復制過程中復制叉的穩(wěn)定[7]。

2 Wee1蛋白激酶抑制劑

MK-1775是一種高效的、選擇性的Wee1小分子抑制劑，屬于吡唑嘧啶衍生物，其半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）為 5 nmol/L[8]。MK-1775與放療、化療相結合的多項臨床試驗（Ⅰ期和Ⅱ期）正在進行中，包括以下試驗：①作為肉瘤細胞和難治性實體瘤的單一療法[9-10]；②作為乳腺癌的單一療法[11]；③聯(lián)合吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑和卡鉑在卵巢癌和結腸癌中的應用[12-13]；④聯(lián)合放射治療在膠質母細胞瘤中的應用[14]；⑤聯(lián)合吉西他濱在胰腺移植瘤中的應用[15]。上述研究表明Wee1蛋白激酶抑制劑在臨床上既可作為單一治療方法，亦可與傳統(tǒng)的DNA損傷劑聯(lián)合使用。

3 Wee1蛋白激酶抑制劑對不同腫瘤細胞的靶向治療作用

3.1 Wee1蛋白激酶抑制劑與乳腺癌細胞

一項評估Wee1沉默對乳腺癌細胞系MCF-7（攜帶野生型p53）和MDA-MB-468（含突變型）抑瘤作用的研究發(fā)現(xiàn)，敲除Wee1基因對細胞凋亡因子p53、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和血管內皮細胞生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）的表達產生影響，結果發(fā)現(xiàn)，Wee1沉默可使MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細胞株的活力降低50%以上；DNA含量測定結果顯示，沉默1周后，細胞的凋亡數(shù)量明顯增加；Wee1蛋白激酶抑制劑也誘導了乳腺癌細胞中p53的表達上調，并且兩種細胞株中VEGF和Bcl-2的表達水平均明顯降低[16]，表明抑制Wee1可導致乳腺癌細胞G2期阻滯消失，進而導致細胞凋亡，而乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-468對Wee1沉默的敏感性似乎與p53的表達水平一致。抑制Wee1會使p53缺陷的腫瘤細胞對放化療敏感，其原因可能是由p53突變的腫瘤細胞G1檢查點缺失和Wee1或CHK1抑制后G2檢查點缺失的聯(lián)合作用導致的，其共同促進細胞增殖，盡管存在未修復的DNA損傷。目前，針對人類表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌患者的治療策略是使用HER2受體靶向藥物曲妥珠單抗，但約70%的患者發(fā)生了對曲妥珠單抗抵抗的現(xiàn)象[17]。同時，新的證據(jù)表明，腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）與曲妥珠單抗抵抗密切相關，其促進了腫瘤復發(fā)和轉移[18]。Sand等[19]的研究表明，MK-1775通過抑制腫瘤細胞的活性和增殖以及誘導其凋亡從而靶向曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌細胞；該研究還發(fā)現(xiàn)，MK-1775是通過抑制黏蛋白1（mucin 1，MUC1）的表達從而靶向誘導CSC的形成。其中，MUC1是一種評價抗曲妥珠單抗功能性的生物標志物，其裂解產物在腫瘤細胞和胚胎干細胞中充當生長因子受體[20]。Mir等[21]發(fā)現(xiàn)Wee1抑制劑可以克服CSC對輻射的抵抗。Zhou等[22]證明了Wee1或CHK1靶向藥物與組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑聯(lián)合治療對某些白血病干細胞樣細胞有效。由此可以假設MK-1775也可以有效地靶向其他惡性腫瘤，但這些惡性腫瘤既往由于CSC亞群而表現(xiàn)出對一線治療的抵抗，因此仍需進一步驗證。

3.2 Wee1蛋白激酶抑制劑與黑色素瘤細胞

通過靶向關鍵細胞的途徑治療黑色素瘤已經取得了重大進展，但許多患者對治療產生了耐藥性或治療后復發(fā)，因此仍需尋找其他靶點。微小RNA（microRNA，miRNA）-155對黑色素瘤細胞的生長具有抑制作用[23]。一項檢測黑色素瘤中miRNA-155表達情況的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)黑色素瘤中的miRNA-155的表達水平較低，但不能預測患者的預后情況；在小鼠實驗性轉移模型中發(fā)現(xiàn)miRNA-155、Wee1的表達情況與黑色素瘤是否發(fā)生轉移有關[24]，確認了Wee1是miRNA-155的新靶點，表明miRNA-155的高表達和Wee1的沉默均可減少小鼠模型中黑色素瘤細胞的轉移，且其能夠通過調節(jié)Wee1激酶的表達從而調控黑色素瘤的轉移，Wee1也對細胞周期具有調節(jié)作用。miRNA-155、Wee1與其他驅動黑色素瘤生長和轉移的細胞過程的關系尚待今后的研究進一步闡明，為黑色素瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

3.3 Wee1抑制劑與結直腸癌細胞

結直腸癌是男性第二高發(fā)的惡性腫瘤，僅次于前列腺癌[25]。早期篩查可降低結直腸癌的發(fā)病率和病死率[26]。然而，傳統(tǒng)化療藥物對晚期結直腸癌患者的治療效果不佳，導致晚期患者預后差。有研究表明，抑制Wee1的表達僅能增強DNA損傷相關藥物和放療對p53缺陷的腫瘤細胞的作用[27]。但也研究表明，Wee1對p53野生型和突變型腫瘤均具有化療增敏效果[28]。Yin等[29]通過分析Wee1抑制劑MK-1775對p53突變型結腸癌細胞HT29和SW480的抗腫瘤作用發(fā)現(xiàn)，MK-1775能明顯抑制結腸癌細胞的增殖，并誘導其凋亡。有研究已發(fā)現(xiàn)，蛋白質印跡法（Western blot）檢測結果顯示，MK-1775可以劑量依賴性地增加DNA損傷標志物組蛋白H2A的一種亞型（γ-H2AX）。MK-1775還可提高HT29和SW480細胞對伊立替康的敏感性[30-31]，與相關研究結果一致[29]。雖然MK-1775單藥治療在p53突變的結腸癌細胞中可以起到抗腫瘤作用，但由于靶向細胞周期檢查點的藥物具有毒性，因此，治療劑量是一個重要問題。有研究采取了適當?shù)牟呗砸蕴岣吣[瘤細胞對細胞毒性效應的敏感性[32-33]。

3.4 Wee1抑制劑與肺癌細胞

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型。早期NSCLC以手術、輔助化療或放療為主，晚期NSCLC患者主要采取針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）/鼠類肉瘤病毒癌基因同源物 B1（v-raf murine sarcoma viraloncogene homolog，BRAF）等基因突變的靶向治療和免疫治療方法[34-35]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是EGFR突變的NSCLC的一線治療藥物。但是，治療后9～14個月，接受EGFR-TKI治療的患者不可避免地會產生耐藥性。有研究表明，在EGFR-TKI耐藥細胞系中，Wee1的表達水平較高，并且隨著G2/M細胞周期的延長，Wee1的表達水平逐漸增加；58.3%（7/12）的獲得性伊克替尼/吉非替尼耐藥患者的Wee1表達水平高于其初始表達水平；當敲除EGFR-TKI耐藥的H1299和PC9/G2細胞的Wee1基因后，順鉑和吉西他濱對兩種細胞株的作用增強，主要體現(xiàn)在H1299組順鉑的IC50值由 8.64 μg/ml降至 3.10 μg/ml，而 PC9/G2 組順鉑的IC50值由3.66 μg/ml降至0.97 μg/ml；表明Wee1基因的敲除可增強EGFR-TKI耐藥的NSCLC的化療敏感性[36]。此外，Liu等[37]對663例NSCLC患者進行了Wee1基因多態(tài)性與化療療效相關性的研究，結果顯示，Wee1 rs3910384 G/G純合基因型晚期NSCLC患者經順鉑和吉西他濱方案治療后，總生存期延長13.5個月，無進展生存期延長3.2個月，3年生存期延長13.5個月，說明Wee1 rs3910384 G/G純合基因型晚期NSCLC患者對順鉑和吉西他濱化療方案敏感。因此，Wee1 rs3910384 G/G純合基因型可作為一個潛在的工具來決定化療方案，以促進NSCLC患者個性化治療的實現(xiàn)。

3.5 Wee1抑制劑與胰腺癌細胞

胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDA）是一種致死性疾病，5年生存率低，缺乏有效的靶向治療方案是其主要原因[25]。盡管從PDA基因組測序中收集了大量的遺傳知識，但目前尚無美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的靶向治療PDA特定遺傳變異的有效方案。有研究證明，PDA細胞中RNA結合蛋白Hur的沉默會使PDA細胞對某些DNA損傷劑敏感，而Hur的過表達會引起抵抗，這與Hur對Wee1表達的快速上調有關[38]。當DNA出現(xiàn)損傷時，Hur對Wee1表達的調節(jié)作用是通過促進CDK1的磷酸化從而激活G2/M期檢查點實現(xiàn)的。這種新的應激反應機制支持PDA的耐藥表型，并證明Wee1的快速翻譯可防止PDA細胞發(fā)生災難性DNA損傷[38-39]。Kausar等[40]研究發(fā)現(xiàn)，MK-1775可使同源重組（homologous recombination，HR）功能正常的PDA細胞對吉西他濱化療敏感，盡管Wee1的抑制機制與G2/M期檢查點的取消有關，但此種機制可能不足以使HR功能正常的PDA細胞致敏。相反，根據(jù)研究結果更支持這樣的假設，即Wee1的抑制對化療的敏感性與HR的抑制有關，持續(xù)的輻射能夠使DNA發(fā)生損傷。因此，抑制HR的修復是MK-1775治療胰腺癌的一個重要作用機制，推斷MK-1775與化療聯(lián)合治療胰腺癌可能有效。

4 小結與展望

MK-1775在多種惡性腫瘤細胞中具有細胞毒性，其機制是由于DNA復制過程中DNA損傷后未及時修復而提前進入分裂期從而引起腫瘤細胞凋亡。MK-1775對Wee1的化學抑制作用可以加強各種DNA損傷劑的細胞毒性，并且在p53缺失的惡性腫瘤中表現(xiàn)得更加明顯，亦支撐了G1檢查點缺陷時腫瘤在很大程度上依賴G2檢查點逃避有絲分裂的致命性的觀點[41]。MK-1775單一用藥或與其他化療藥物聯(lián)合使用對多數(shù)惡性腫瘤均表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性。然而，目前仍存在一些問題，如當Wee1抑制劑與DNA損傷藥物聯(lián)合使用時，Wee1的表達水平在聯(lián)合用藥的過程中是否能夠保持穩(wěn)定；MK-1775的療效是否與其他分子環(huán)境等有關。因此，未來的研究需要確定細胞周期檢查點、DNA損傷修復和DNA復制對Wee1抑制劑單獨用藥或與其他藥物聯(lián)合治療腫瘤時的作用。