環氧化酶-2、基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9在非小細胞肺癌中的表達及意義

劉東雷，吳愷，吉浩哲，兗克達，王清清

鄭州大學第一附屬醫院胸外科，鄭州 450000

非小細胞肺癌是臨床常見的肺癌類型之一，發病率高，病死率增長迅速，嚴重影響患者生命安全。非小細胞肺癌占所有肺癌的75%～80%，而且由于肺癌患者早期臨床體征不明顯，肺癌的侵襲與轉移具有隱匿性，對開展臨床治療產生了較大的影響[1]。研究顯示非小細胞肺癌具有向周圍組織浸潤和遠處轉移的特點，而且即使開展臨床治療仍具有較高的復發率。隨著現代醫學的飛速發展，越來越多的研究向分子生物學機制發展，基質金屬蛋白酶屬于人體重要的酶類，可以特異性地降解細胞外基質和基底膜，因此一直被認為是腫瘤侵襲與轉移過程中重要的金屬蛋白酶之一；環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）則是常見的限速酶，可以催化花生四烯酸轉變為前列腺素與血栓素，對腫瘤微環境具有改變作用，而且在促進腫瘤血管形成方面具有重要意義[2]。本研究分析了COX-2、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）在非小細胞肺癌中的表達及意義，以期為臨床提供指導和依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2018年12月鄭州大學第一附屬醫院收治的非小細胞肺癌患者的病歷資料。納入標準：①均經病理學確診為非小細胞肺癌；②術前未行放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料保存完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤。根據納入、排除標準，共納入78例非小細胞肺癌患者，其中男性40例，女性38例；年齡35～81歲，中位年齡59歲。取78例患者的非小細胞肺癌組織，同時選取癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）作為對照。

1.2 檢測方法

采用免疫組化法測定COX-2、MMP2、MMP9濃度變化，試劑均購自上海藍怡科技股份有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。制作石蠟切片，烤片待用，常規二甲苯脫蠟并水化，阻斷滅活內源性過氧化酶，隨后進行抗原修復，采用檸檬酸緩沖液作為抗原修復液，在切片中加入10%正常山羊血清封閉降低背景，清除血清后甩去磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），加入0.04%二氨基聯苯胺和0.03%過氧化氫溶液進行顯色，在顯微鏡下控制染色深度，雙蒸餾水沖洗終止染色，蘇木素復染30 s，雙蒸餾水沖洗數次后進行脫水透明，隨后在鏡下進行觀察。

1.3 結果判斷

參照Fromowitz等[3]提出的標準，隨機選取5個視野，每個視野讀取100個細胞，對染色強度和陽性細胞（著色部位均主要為細胞質）比例進行評分。染色強度：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度和陽性細胞比例得分之和≥4分為陽性表達。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌組織和癌旁組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達情況的比較

非小細胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達率均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 非小細胞肺癌組織和癌旁組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9表達情況的比較

腺癌、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化的非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織中COX-2陽性表達率分別明顯高于鱗狀細胞癌、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化患者，差異均有統計學意義（χ2=6.760、13.271、21.231，P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織中MMP2陽性表達率分別明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（χ2=7.371、18.992、12.570，P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織中MMP9陽性表達率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（χ2=4.144、7.025、6.947，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9的表達情況（n=78）

2.3 相關性分析

COX-2與 MMP2、MMP9表達呈正相關（r=0.321、0.243，P＜0.05），MMP2與MMP9表達呈正相關（r=0.448，P＜0.05）。

3 討論

非小細胞肺癌屬于臨床常見的肺部惡性腫瘤，目前發病率和病死率均位居榜首，近年來發病率呈逐年升高趨勢，已成為威脅人類身心健康的重要問題之一。肺癌具有發病隱匿、侵襲性高等特點，因此早期診斷對降低肺癌病死率具有至關重要的意義。目前臨床診斷肺癌的方法較多，包括臨床癥狀檢查、影像學檢查、組織病理檢查以及腫瘤標志物檢測等方法，但是多數患者早期臨床癥狀不明顯，因此單純依靠臨床癥狀不具有特異性；影像學檢查可以反映腫瘤病灶的大小和變化，但是無法對腫瘤細胞活動進行顯現，而且在微小病灶的檢出上效果一般[4]；病理學檢查一直是臨床肺癌診斷的金標準，特異度較高，但是具有創傷性，而且受到組織類型以及標本留取等多種因素影響，患者常無法接受，在早期診斷和評價治療效果方面具有局限性[5]。近年來隨著現代醫療技術的飛速發展，在分子生物學和免疫學領域發現細胞在癌變以及發生發展過程中會分泌活性物質，主要存在于肺癌組織和體液中，通過技術手段檢測其在腫瘤患者體內的含量可評價患者治療效果，為早期診斷和評估預后奠定了基礎[6]。研究發現非小細胞肺癌患者存在明顯的個體性差異，因此近年來個體化治療根據肺癌患者藥理學以及基因學特點采用最佳治療方法，提升臨床療效，延長患者生存時間，分子生物學標志物的應用可以評估患者治療后是否具有更高的復發和死亡風險，為臨床調整治療方法奠定了基礎[7]。近年來尋找診斷肺癌的特異性標志物是臨床研究的熱點，大量研究證實細胞凋亡在腫瘤發生發展中起到了重要作用，凋亡是人體正常細胞維持穩定的重要保護機制，細胞凋亡參與了人體器官發育以及功能維持，腫瘤的發生則正是細胞凋亡紊亂導致，細胞凋亡過程被抑制以及基因的改變造成細胞轉化突變，最終演變成為惡性腫瘤的發生和進展[8]。

本研究觀察了COX-2、MMP2、MMP9在非小細胞肺癌患者體內的變化情況，環氧化酶屬于分解花生四烯酸形成內源性前列腺素的限速酶，對于腫瘤多種生物學行為具有調控作用，COX-2屬于重要的同功酶之一，一般在靜息狀態下不表達，當細胞被各種因子刺激時會快速合成，參與腫瘤發生發展等病理過程，最早在1998年有學者研究發現利用免疫組化法在非典型性腺瘤樣增生組織及腫瘤細胞中發現COX-2蛋白表達明顯增加[9]。目前大量研究證實一方面COX-2能夠促進惡性腫瘤細胞增殖，同時還可以抑制腫瘤細胞發生凋亡[10]；另一方面COX-2可以促進惡性腫瘤血管形成，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，還可以參與致癌物質代謝過程[11]。還有學者指出COX-2在腫瘤新生血管和轉移病灶的血管中均表達，可以通過人體多種信號轉導途徑上調體內血管內皮生長因子的表達，促進了淋巴血管形成，還可以通過增加血管源性趨化性細胞因子表達促進非小細胞肺癌發生和發展[12]。隨著分子生物學的研究進展，細胞外基質變化與調節作用在腫瘤發生發展過程中也越來越受到關注，細胞外基質分泌后在基底膜與細胞間質之間構成網架結構，可以為腫瘤的形成和發展提供組織保障，因此越來越多的研究關注基質成分變化，以指導臨床診斷和治療，基質金屬蛋白酶家族在腫瘤生長過程中發揮著重要作用[13]。基質金屬蛋白酶為鈣離子、鋅離子依賴性蛋白質水解酶，可以破壞細胞微環境穩態，破壞人體防御腫瘤侵犯的天然屏障，因此在腫瘤發生發展中起到關鍵作用[14]。MMP9屬于基質金屬蛋白酶家族成員之一，有研究指出基底膜腫瘤穿透基底膜、穿透血管的全過程均需要基質金屬蛋白酶參與，其激活過程極為復雜，通過打破基質金屬蛋白酶與其抑制因子之間的平衡關系發揮作用。一方面MMP9可以對膠原進行降解，激活其他類型基質金屬蛋白酶，參與基質降解過程，促進了腫瘤生長，另一方面MMP9可以改建細胞外基質，破壞正常的基底膜結構導致腫瘤血管形成，因此在腫瘤發生和發展過程中具有重要作用。MMP2也是重要的Ⅳ型膠原酶，能夠選擇性降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，其分布廣泛，在組織與細胞出現癌變時表達明顯升高，其分解Ⅳ型膠原酶過多會導致腫瘤細胞擴散和轉移，而且其在肺癌組織中過度表達與患者病理分型、分化情況以及淋巴結轉移關系密切，在肺癌發生發展過程中起到了重要的作用[15]。

本研究結果顯示，非小細胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達率均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義，說明在非小細胞肺癌中存在COX-2、MMP2和MMP9高表達。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織中MMP2、MMP9陽性表達率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移患者，說明MMP2和MMP9在不同臨床分期、分化程度以及淋巴結轉移方面存在差異性；腺癌、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化的非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織中COX-2陽性表達率分別明顯高于鱗狀細胞癌、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化患者，說明COX-2在不同腫瘤類型、臨床分期、分化程度方面存在差異性。通過相關性分析發現，COX-2與MMP2、MMP9表達呈正相關，MMP2與MMP9表達呈正相關，說明三者在非小細胞肺癌患者表達中存在相關性。本研究優勢在于證實了非小細胞肺癌患者體內存在COX-2、MMP2和MMP9過表達，為臨床開展早期診斷和評估肺癌患者臨床分期、腫瘤類型、轉移情況、分化程度提供了一定的依據，但是本研究納入患者數量有限，隨訪時間短，因此還需要開展多中心、大樣本量、長期隨訪深入研究。

綜上所述，非小細胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9表達明顯升高，與臨床特征有一定關系，三者間表達存在相關性。