口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1、基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)水平及臨床意義

楊易，蘇波，馬原軍，周順成

解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院漢口院區(qū)口腔科，武漢 430012

口腔鱗狀細(xì)胞癌是臨床中常見的口腔頜面部惡性腫瘤之一，雖然近年來該病的治療方法已有了較大的進(jìn)步，但大部分患者因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡[1]。侵襲及轉(zhuǎn)移對(duì)于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，其中細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入血管及淋巴是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要原因，細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包括膠原、蛋白聚糖及糖蛋白等，上述物質(zhì)可在絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等作用下被降解，其中MMP在惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用被廣泛關(guān)注，其在血管形成、傷口愈合、腫瘤浸潤等方面均具有重要作用[2-3]。目前發(fā)現(xiàn)的MMP類型已超過23種，其中膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1（membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）及MMP2已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。本研究探討了口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MT1-MMP、MMP2的表達(dá)水平及與患者臨床特征和生存情況的關(guān)系，旨在為口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床診治提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年1月至2016年1月于解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院漢口院區(qū)接受根治性手術(shù)治療的口腔癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查證實(shí)為原發(fā)性口腔鱗狀細(xì)胞癌；②接受根治性手術(shù)治療，且術(shù)前均未接受過放療、化療或免疫治療；③神志清醒，智力正常，與醫(yī)護(hù)人員交流無障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并糖尿病、感染、貧血；③合并高血壓、心腦血管疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入83例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者。其中，男49例，女34例；年齡39～74歲，平均（58.39±6.93）歲；病變部位：牙齦15例，舌部31例，頰黏膜28例，腭部6例，其他3例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

步驟如下：①將手術(shù)獲得的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本置于10%中性福爾馬林固定液中，室溫固定24 h，常規(guī)脫水后以石蠟包埋，將包埋后的組織切成4 μm厚的切片，置于烘箱中，67 ℃烘片2 h，脫蠟，以100%、95%、80%、70%的梯度乙醇進(jìn)行水化后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min；②將沖洗后的切片置于0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，微波抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫后，PBS沖洗3次，每次5 min；③除去PBS，采用新配制的3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；④除去PBS，加入山羊血清，室內(nèi)孵育20 min以封閉非特異性抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)；⑤將多余的血清除去后，加入一抗 MMP2 或 MT1-MMP 50 μl，置于濕盒中4℃孵育過夜，次日在室溫下復(fù)溫1 h后以PBS沖洗3次，每次5 min；⑥除去PBS，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫放置15 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑦加入新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB），室溫孵育5 min，置于顯微鏡下觀察，顯色后以純凈水沖洗，終止染色；⑧蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，以1%鹽酸乙醇分化，氨水促藍(lán)液返藍(lán)，超純水沖洗，80%、95%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。以PBS代替一抗作為對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

以免疫組化半定量分析方法對(duì)MT1-MMP、MMP2的表達(dá)情況進(jìn)行判定，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)染色程度評(píng)分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分，10%～49%為2分，50%～80%為3分，＞80%為4分。染色程度評(píng)分與陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加，≤1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），≥5分為（+++）。其中（-）為陰性，（+）為弱陽性，（++）與（+++）為強(qiáng)陽性[5]。于200倍顯微鏡下選取5個(gè)以上視野進(jìn)行觀察，注意避免壞死區(qū)，由2名具有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)且中級(jí)以上職稱的病理科醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，結(jié)果不一致時(shí)請(qǐng)第3名專家進(jìn)行判定。

1.4 隨訪

采用門診或電話方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019年1月30日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Spearman相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征口腔鱗狀細(xì)胞癌患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MT1-MMP、MMP2表達(dá)情況的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MT1-MMP的強(qiáng)陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未復(fù)發(fā)的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.971、9.169、6.556、8.204，P＜0.05）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP2的強(qiáng)陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未復(fù)發(fā)的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.459、5.655、5.032、4.814，P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、浸潤情況口腔鱗狀細(xì)胞癌患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MT1-MMP和MMP2的強(qiáng)陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征口腔鱗狀細(xì)胞癌患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MT1-MMP、MMP2的表達(dá)情況（n=83）

2.2 MT1-MMP與MMP2表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中MT1-MMP與MMP2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.471，P＜0.05）。（表2）

表2 口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中MT1-MMP與MMP2的表達(dá)情況

2.3 生存分析

MT1-MMP強(qiáng)陽性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為24個(gè)月，明顯短于MT1-MMP弱陽性/陰性表達(dá)患者的32個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.415，P＜0.01）。MMP2強(qiáng)陽性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為24個(gè)月，明顯短于MMP2弱陽性/陰性表達(dá)患者的33個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.895，P＜0.01）。（圖1、圖2）

圖1 MT1-MMP強(qiáng)陽性（n=37）與弱陽性/陰性（n=46）口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的生存曲線

圖2 MMP2強(qiáng)陽性（n=41）與弱陽性/陰性（n=42）口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的生存曲線

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是臨床中最常見的口腔癌，其發(fā)病率呈逐年上升之勢(shì)。惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫離并向遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的一個(gè)重要原因，口腔癌患者死因多為轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。口腔癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)由多方面因素影響的過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)是惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的第一道防線[6-8]。MMP是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面均具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[9]。

本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MT1-MMP和MMP2的強(qiáng)陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未復(fù)發(fā)的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、浸潤情況口腔鱗狀細(xì)胞癌患者口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MT1-MMP和MMP2的強(qiáng)陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中MT1-MMP和MMP2的表達(dá)情況與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及預(yù)后情況有關(guān)。雖然大部分MMP以可溶性酶原的形式存在，但近年來越來越多的膜型MMP被發(fā)現(xiàn)[10-13]：①M(fèi)T1，2，3及5-MMP主要以Ⅰ型跨膜區(qū)與膜相連；②MT4、6-MMP以糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）與膜相連接；③MT23-MMP通過Ⅱ型跨膜區(qū)相連。其中MT1-MMP為首個(gè)鑒定出來的膜型MMP，目前已被證實(shí)在前列腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)。MT1-MMP不僅可直接或間接降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而為惡性腫瘤的遷移侵襲提供便利，還可脫落細(xì)胞表面分子并具有激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的作用，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。因此，對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中MT1-MMP的表達(dá)水平及其與臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析具有重要意義。MMP2是MT1-MMP激活產(chǎn)物，為鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，研究顯示，其可降解Ⅳ、Ⅴ型膠原及明膠等細(xì)胞外基質(zhì)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤血管生成及細(xì)胞生長的作用，被證實(shí)在多種惡性腫瘤組織中明顯高表達(dá)[14]。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MT1-MMP與MMP2的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。其原因可能是MT1-MMP可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原及明膠、纖連蛋白、纖維蛋白等大分子，同時(shí)可介導(dǎo)激活MMP2，從而進(jìn)一步降解更多的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。MMP2酶原經(jīng)MT1-MMP催化后與組織金屬蛋白酶抑制物2（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）的 N 端相連，使TIMP2的C端與MMP2酶原的血紅素樣區(qū)域在空間上結(jié)合，該三聚體使MMP2酶原聚集于細(xì)胞表面，而與TIMP2結(jié)合的MTI-MMP易于激活MMP2酶原，兩者表達(dá)具有協(xié)同作用，因此表現(xiàn)為正相關(guān)[15]。本研究的生存分析結(jié)果顯示，MT1-MMP強(qiáng)陽性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為24個(gè)月，明顯短于MT1-MMP弱陽性/陰性表達(dá)患者的32個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MMP2強(qiáng)陽性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為24個(gè)月，明顯短于MMP2弱陽性/陰性表達(dá)患者的33個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示MT1-MMP及MMP2陽性表達(dá)可能是口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展過程中的兩個(gè)分子事件，可引起患者預(yù)后不良，可能與上述基因表達(dá)異常可促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中MT1-MMP、MMP2的表達(dá)情況與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后有關(guān)，強(qiáng)陽性表達(dá)患者的預(yù)后更差，MT1-MMP、MMP2對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)具有一定的價(jià)值。