知母皂苷對慢性乙醇中毒小鼠學習記憶能力和突觸可塑性的影響

趙喆 張昊婧 隋海娟 劉琪 劉卓

(1錦州醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，遼寧 錦州 121000；2鐵嶺衛生職業學院)

研究表明，長期過量飲酒會使大腦活動受抑制，引起神經損傷、導致學習與記憶障礙〔1，2〕。突觸可塑性參與神經系統生長發育和損傷修復，在慢性酒精中毒的學習記憶障礙形成中扮演了重要角色。長期乙醇使用導致了突觸可塑性功能損傷，并減少突觸特異性標志蛋白的表達，而直接對酒精引起的結構可塑性分子機制的研究仍然不清楚〔3，4〕。知母皂苷(SAaB)由百合科植物知母的根莖炮制而成，有防治老年癡呆癥〔5〕、抗炎〔6〕、抗凝血、抗氧化〔7〕等廣泛的生物活性和藥理作用。本實驗探討SAaB對慢性乙醇中毒所致小鼠空間學習記憶損害和突觸可塑性相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器 SPF級雄性12月齡昆明小鼠，體重22～30 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001，NO：211002300014062。SAaB由成都普瑞法科技開發有限公司提供，批號：S08039，高效液相色譜法(HPLC)分析純度>98%，分子質量為416.64。鼠突觸素(SYP)單克隆抗體、兔突觸后致密蛋白(PSD)95多克隆抗體、突觸小體相關蛋白(SNAP25)抗體及山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司；β-actin抗體購自Beyotime試劑公司；電化學發光(ECL)試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，其他相關試劑由錦州醫科大學藥理學實驗室提供〔8〕。Morris水迷宮系統購自中國淮北正華生物儀器設備有限公司，熒光顯微鏡購自(ZDM-500Z)德國Leica，全自動熒光和化學發光成像分析系統(Bio Spectrum 510)購自美國UVP，微量紫外分光光度計(Nano Drop 2000c)購自美國Thermo Scientific等。

1.2實驗動物分組及處理 40只小鼠采用隨機數字法分為正常對照組(NC組)、乙醇組(E組)和SAaB低劑量組(SL組)、SAaB高劑量組(SH組)各10只。乙醇組和SAaB組小鼠灌胃(ig)給予30%(V/V)乙醇10 ml/kg制作慢性乙醇中毒小鼠模型，對照組ig等量蒸餾水，連續4 w。灌胃同時分別對SL組和SH組腹腔注射(ip)SAaB 100、200 mg/kg，NC組和E組ip等量生理鹽水，連續4 w。

1.3Morris水迷宮實驗 各組進行Morris水迷宮實驗，水迷宮為直徑100 cm、高50 cm的圓形水池，水深25 cm，水溫22～24℃，內置直徑7.5 cm的可移動平臺。①定位航行實驗：第1～3天為學習階段，平臺高出水面1 cm置于NE象限，參照物懸掛于平臺對側。將小鼠面向池壁從距平臺最遠象限放入水中，若在120 s內成功找到平臺，則更換入水位置進行第2次訓練；若120 s內不能找到平臺，由實驗者將其引上平臺停留10 s，每只訓練4次。第4～8天移動平臺至SE象限，參照物移動至平臺對側，加水使水面沒過平臺，記錄找到平臺所需要的時間(逃避潛伏期)。②空間探索實驗：定位航行實驗結束后的次日移除平臺，參照物不動，其余方法同前。記錄在目標象限游泳時間占總游泳時間的百分比，以判斷記憶存儲、提取及再現能力。

1.4Western印跡法測定海馬組織突觸相關蛋白 水迷宮試驗后，每組任選4只小鼠麻醉后直接斷頭，收集大腦海馬組織。經過組織蛋白提取、電泳、轉膜、雜交、顯色，測定各組海馬區SNAP25、SYP、PSD95和神經元核蛋白(NeuN)表達水平變化。

1.5免疫組織化學觀察海馬NeuN表達 從每組中任選4只作免疫組化檢測，灌流取全腦，固定，制作冰凍切片行增強免疫組織化學染色(IHC)，在熒光顯微鏡下觀察，并進行照相及分析，觀察NeuN表達情況。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和Post-hoc多重比較。

2 結 果

2.1空間學習記憶能力 在定位航行實驗中，各組逃避潛伏期隨著訓練時間的延長逐漸縮短。第4～8天，與NC組相比，E組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；SL和SH組逃避潛伏期較E組明顯縮短(P<0.05)，見表1?？臻g探索實驗中，與NC組相比，E組目標象限停留時間明顯縮短，穿越平臺次數明顯減少(P<0.05)，SL和SH組在平臺象限停留時間較E組明顯延長，穿越平臺次數明顯增加(P<0.05)，見表2，圖1。

表1 各組不同訓練時間逃避潛伏期比較

表2 各組平臺象限停留時間占總游泳時間百分比和穿越平臺次數比較

圖1 各組空間探索試驗游泳軌跡

2.2海馬組織突觸相關蛋白測定 與NC組相比，E組海馬組織中SNAP25、SYP、PSD95水平明顯減少(P<0.01)，與E組比較，SL和SH組SNAP25、SYP、PSD95水平明顯升高(P<0.01)。見表3和圖2。

表3 各組海馬組織中SNAP25、SYP、PSD95蛋白表達水平

圖2 各組海馬組織SNAP25、SYP和PSD95表達水平

2.3海馬齒狀回NeuN形態學變化 與NC組相比，E組海馬DG區NeuN數目明顯減少(紅色)，細胞出現碎裂，細胞核不完整。SH組較E組NeuN表達明顯增多，細胞形態及完整度均有所增強。見圖3。

圖3 各組海馬齒狀回NeuN增強免疫熒光染色(×200)

3 討 論

研究表明，乙醇及其在代謝過程中產生的乙醛透過血腦屏障進入腦內，通過影響不同的神經通路及神經遞質釋放，使機體出現多種行為改變及神經損傷〔8～10〕。海馬是學習和記憶的關鍵部位，NeuN是一種表達在成熟神經細胞核中的特異性核蛋白，研究發現長期酒精暴露使小鼠成熟神經元的數量明顯減少〔11〕。本研究證明了SAaB對慢性乙醇中毒引起的神經元損傷具有保護作用。

在神經信息傳遞過程中，突觸是傳遞的關鍵部位，也是神經可塑性變化中最敏感的部位，在神經系統發育過程中，不斷有新的突觸形成〔12〕。如損傷、學習等適應性變化的過程中，突觸表現出強大的變異性，通過從神經元到神經環路的適應性變化以維持神經功能相對穩定，這種變化即突觸可塑性。在突觸前、后膜中，存在許多可調節突觸可塑性的信號分子，突觸前膜上的SNAP25，為神經遞質釋放所必需的突觸前膜蛋白〔13〕，研究發現酒精處理的小鼠大腦中SNAP25含量明顯減少，小鼠出現明顯的學習記憶障礙，表現為Morris水迷宮試驗潛伏期延長，這一結果與本研究相一致。SYP和PSD95雖產生部位不同，但都與突觸的形成和成熟密切相關〔14〕。其中SYP數量減少提示突觸數量減少，突觸囊泡減少，進而影響神經遞質的釋放，SYP丟失程度與記憶缺失程度成正相關，在行為上表現為學習記憶障礙〔15〕。而突觸后致密物質是突觸可塑性中最為敏感的物質，小鼠連續飲用酒精2個月后突觸后致密物質厚度顯著變小，說明其內的各種蛋白的量減少，而這些蛋白減少必定會使神經遞質的傳遞速度降低〔16〕。本研究證明SAaB可明顯改善這種損傷性改變，其機制可能與通過增加突觸相關蛋白，進而影響突觸可塑性有關。

綜上，SAaB可明顯改善慢性乙醇中毒所致的小鼠空間學習記憶損害，可能是通過對海馬組織神經元的保護和調節突觸可塑性相關的信號分子有關。