當歸紅芪超濾物對輻射致新生大鼠心肌細胞氧化應激和炎性因子的影響

劉旭幫 張朝華 孫丹丹 趙信科

(1鄭州人民醫院心血管內科，河南 鄭州 450000，2甘肅中醫藥大學附屬醫院心血管內科)

放射性心臟疾病一般是指心臟受到放射性物質輻射后而發生的一類損傷性病變，隨著放射性治療在惡性腫瘤中的廣泛應用，放射性心臟疾病的臨床報告逐漸增多，患者主要臨床表現為心律失常、心包炎、心肌纖維化及心肌梗死等，目前仍無有效的治療手段，給患者的身心健康造成極大影響〔1,2〕。隨著中醫臨床研究的不斷發展，研究發現當歸、紅芪等中藥具有抗氧化損傷及抗輻射等作用〔3,4〕，本研究通過觀察當歸紅芪超濾物對輻射后乳鼠心肌組織氧化應激和炎性因子相關指標的影響，為放射性心臟疾病的發生機制及中醫治療提供依據。

1 材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 選擇1～3日齡的Wistar大鼠10只作為實驗動物，雌雄不限，體重6～10 g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2實驗藥物 當歸紅芪超濾物的制備過程〔5〕：當歸和紅芪飲片按照1∶5的比例進行混合，水煎煮3次后，過濾雜質并加熱濃縮，冷卻至室溫后使用陶瓷膜微濾當歸紅芪水煎劑濃縮液，具體技術參數：壓力0.5 kPa/m3、溫度25 ℃、流量100 L/(h·m3)，選用截留相對分子量為1×105PNA的中空纖維超濾膜對微濾后的濃縮液進行超濾處理，具體技術參數：膜面積0.25 m2、系統壓力≤5.0 bar、過濾能力 2～30 L/h，最后將濃縮超濾液噴霧干燥成粉末，分裝置于干燥器中備用。

1.2實驗方法

1.2.1心肌細胞原代培養 無菌條件下取Wistar大鼠心尖部組織，使用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，將心肌組織剪成約1 mm3大小后移入離心管中，加入0.08%胰蛋白液進行反復吹打，動作要輕柔，然后置于37℃水浴消化10 min，棄去上清液，再加入0.08%胰蛋白液和0.05%膠原酶，反復吹打后置于37℃水浴消化8 min，取上清液移入新離心管中，加入等體積含15%新生牛血清的DMEM培養液終止消化，將混合液以1 500 r/min離心10 min后棄去上清液，加入培養液混懸細胞沉淀，放置于37℃ 5%CO2培養箱中進行細胞培養。

1.2.2實驗分組 空白組常規細胞培養48 h后換液，繼續培養24 h；模型組常規細胞培養48 h后換液，采用6 MV-X線垂直照射，放射野為30 cm×30 cm，靶區照射劑量DT為200 cGy，以6 Gy作用心肌細胞，繼續培養24 h；干預組根據當歸紅芪超濾物濃度的不同，分別加入含3 mg/ml(低劑量干預組)、6 mg/ml(中劑量干預組)和9 mg/ml(高劑量干預組)當歸紅芪超濾物至培養基中，培養48 h后換液，采用同模型組相同的X線進行照射，使用加入上述濃度當歸紅芪超濾物的培養基繼續培養24 h。

1.3觀察指標

1.3.1細胞活性檢測 將心肌細胞以1×105個/ml接種于96孔培養板中，100 μl/孔，各組經過相應處理后，每孔加入100 μl 噻唑藍(MTT)于37 ℃孵育4 h后，棄去培養液，然后每孔再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩使結晶物溶解。選擇570 nm 波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)，計算生長抑制率 =(空白組 OD值-待檢測組OD值)/ 空白組OD值 ×100%

1.3.2氧化應激指標檢測 各組心肌細胞經過相應處理后，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)含量，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量，2,4-二硝基苯肼顯色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作，并通過分光光度計比色法進行檢測。

1.3.3炎性因子指標檢測 各組心肌細胞經過相應處理后，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β水平，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.1當歸紅芪超濾物對輻射致心肌細胞生長抑制率的影響 模型組OD值顯著低于空白組(P<0.05)，說明模型組心肌細胞存活數量明顯減少；各干預組心肌細胞生長抑制率均顯著低于模型組(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 當歸紅芪超濾物對輻射致心肌細胞生長抑制率的影響

2.2當歸紅芪超濾物對輻射致心肌細胞氧化應激的影響 模型組心肌細胞SOD含量低于空白組，MDA和LDH含量高于空白組，差異均有統計學意義(P<0.05)；各干預組心肌細胞SOD含量均高于模型組，MDA和LDH含量均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表2。

表2 當歸紅芪超濾物對輻射致心肌細胞氧化應激的影響

2.3當歸紅芪超濾物對輻射致心肌細胞炎性因子的影響 模型組心肌細胞TNF-α和IL-1β含量均高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；各干預組心肌細胞TNF-α和IL-1β含量均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。見表3。

表3 當歸紅芪超濾物對輻射致心肌細胞炎性因子的影響

3 討 論

放療作為腫瘤疾病治療的主要手段之一，既可與手術、化療等聯合使用，也可單獨使用，近年來放療技術發展十分迅速，但是臨床表明，放療會導致患者心臟受到輻射損傷，增加心律失常、心包炎、心肌纖維化及心肌梗死等放射性心臟疾病的發生率〔6〕。放射性心臟疾病的發生機制較為復雜，可能與放射性直接損傷心肌細胞、血管及淋巴管等有關，因此明確疾病的發生機制對于改善預后具有重要意義〔7〕。本研究發現，模型組心肌細胞SOD含量明顯低于空白組，MDA、LDH及TNF-α和IL-1β含量均明顯高于空白組，說明新生大鼠心肌細胞在受到輻射后，機體抗氧化系統失衡致使氧自由基大量蓄積，產生過氧化作用，造成心肌細胞膜、核酸及蛋白質等生物大分子氧化損傷，導致心肌細胞形態、功能發生異常〔8,9〕，并且心肌還會產生促炎趨化因子，刺激TNF-α和IL-1β等炎性細胞因子合成，上調內皮細胞黏附分子表達，導致炎癥細胞大量滲出，發生局部炎癥反應，造成心臟微血管損傷及心肌細胞壞死等，誘發放射性心臟病〔10,11〕。

中醫理論認為，輻射損傷屬于熱毒蘊結所致脾腎虛化和氣血津液運行失常，因此應以益氣補血、化瘀通脈的治療為主，并兼顧提高免疫力、抗氧化應激以及抗輻射的中醫治療〔12〕。當歸紅芪超濾物是來源于當歸補血湯，主要成分為當歸和紅芪中藥，其中當歸補血活血、通經活絡，現代藥理學研究表明，當歸具有抗癌作用，用于化療后正氣虛弱的患者，可扶正抗癌，并具有抗氧化作用，可通過直接消除自由基，抑制氧化反應和自由基反應，減輕心臟組織的損害〔13〕；紅芪可補氣固表，現代藥理學研究表明，紅芪具有調節免疫功能、抗炎和抗氧化作用，并可擴張冠狀動脈，改善心肌供血，增強心肌收縮力〔14〕。李應東等〔15〕研究表明，歸紅芪超濾物可提高大鼠心肌組織中的SOD和谷胱甘肽-過氧化物酶的活性，并降低MDA含量，進而發揮抗衰老作用；陳雪娟等〔16〕研究表明，當歸紅芪超濾物可通過降低心肌梗死大鼠LDH和LDH 同工酶活性，發揮抗心肌缺血損傷作用，有效保護大鼠心肌組織。本研究結果說明當歸紅芪超濾物可有效減輕輻射致新生大鼠心肌細胞的氧化損傷和免疫反應，進而保護心肌細胞，表現為各干預組心肌細胞生長抑制率明顯低于模型組，同時本研究還發現，當歸紅芪超濾物對于心肌細胞生長抑制率、氧化應激及炎性因子指標放入改善呈現明顯地劑量依賴性，說明用藥劑量與心肌保護作用存在密切關系。

綜上所述，當歸紅芪超濾物可有效改善輻射致新生大鼠心肌細胞的氧化應激及炎性因子指標，避免心肌細胞受損，并與劑量存在密切關系。